(protocol)
1/ 4
Real-time PCR 检测
实验流程描述：
收集生长状态良好的目的细胞，提取RNA，并反转录成cDNA采用real time PCR 方法检测 目的基因的表达情况。
实验材料：
1．主要试剂 REAGENTS Trizol M-MLV dNTPs oligo dT Rnase Inhibitor Primer(R&F) SYBR Master Mixture COMPANY Invitrogen 逆转录酶 promega 上海生工 promega 上海吉凯 TAKARA COMPANY Thermo 上海天能 TAKARA 公司 Cat.No 2000/2000C TP800 Cat.No. 15596-026 promega M1705 U1240 B0205 N2115 DRR041B 2． 主要仪器 EQUIPMENTS Nanodrop 分光光度计 稳压电泳仪 Real time PCR 仪器
实验步骤：
1 总RNA 抽提（根据Invitrogen 公司的Trizol 操作说明书进行）
1) 收集细胞，2000rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5 ml EP 管中；
2) 每管加入200 μl 氯仿，用手上下颠倒eppendorf 管15s，室温静置10min； 3) 4℃，12800 rpm，离心10min；
4) 吸取上层液体移至新的1.5 ml EP 管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10 min； 5) 4℃，12800 rpm 离心10 min 后，弃上清；
6) 加入1 ml 75%乙醇（用DEPC水新鲜配制），洗涤沉淀；
2/ 4
7) 4℃，11800 rpm 离心5 min，弃去大部分上清； 8) 4℃，11800 rpm 离心5 min，弃去上清；室温干燥；
9) 待RNA 沉淀基本透明时，加入RNase-free 水（加入体积视RNA沉淀量而定）至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA 的浓度及质量。
2 RNA 逆转录获得cDNA（根据Promega 公司M-MLV 操作说明书进行）
实验所需耗材均购自Axygen，具体步骤如下：
1) 将1 μl Oligo dT(0.5μg/μl) 和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H2O至10ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT 和模板退火；
2) 按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心；
试剂 5×RT buffer 10mMdNTPs Rnasin（40U/ul） M-MLV-RTase（200U/ul） RNase-Free H2O 每管加入量 4 μl 2 μl 0.4 μl 1 μl 2.6 μl 注：dNTPs 是dATP , dCTP, dGTP, dTTP 的混合，浓度为10mM 3) 上述体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min 使RT 酶失活； 4) 将得到的RT 产物--cDNA 置于-80℃保存备用。
3 Real-time PCR 检测
1) 按下列比例配置反应体系：
试剂 SYBR premix ex taq: 上游引物（2.5μM） 下游引物（2.5μM） cDNA RNase-Free H2O 每管加入量 10.0 μl 0.5μl 0.5μl 1.0μl 8.0 μl 2)两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线，程序如下：
3/ 4
4．数据分析
见实验报告
4/ 4
