基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基用于霉菌的分离培养。 【材料与用品】
1．材料与试剂
牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4?7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。 【仪器与用品】
天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制
1．培养基成分
牛肉膏 0. 3g 蛋白胨 1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水 100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法
（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
二、高氏一号培养基的配制
1．培养基成分
可溶性淀粉 20g KNO3 1g NaCl 0.5g
K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 20g 水 1000mL pH 7.2～7.4 2．配制方法
（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lLNaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
三、马丁氏培养基的配制 1．培养基成分
葡萄糖 10g 蛋白胨 5g
K2HPO4 1g MgSO4?7H2O 0.5g 琼脂 16g 水 1000mL
链霉素溶液（10000U/ml） 3.3mL（临用前加入）的
2．配制方法
（1）称量：称取培养基各成分的所需量。
（2）溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分。 （3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（4）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （5）加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60℃左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。 【思考题】
1． 制作平板培养基的注意事项是什么？
2． 培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养
基暂时放置何处？
3． 如何检查灭菌后的培养基是否无菌？
4． 在马丁氏培养基的配制中，链霉素为什么要临用前才加入？
2 四大类微生物的分离和培养
【目的要求】
1．掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离技术。 2．学习从样品种分离、纯化出所需菌株。
3．了解培养细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 【基本原理】
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量较多。本实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌，从面曲中分离酵母菌。
为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品的季节、气温条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品种各类微生物相互干扰。细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10％酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。酵母菌和霉菌都喜欢酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH5时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以，分离酵母菌时只要选择适宜的培养基和pH，可降低细菌增值率，霉菌生长慢，也不干扰酵母
菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增值率，一般培养基临用前添加灭过菌的链霉素。 【材料与用品】
1．菌源
选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，酵母菌分离采用面曲。
2．培养基
肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基 3．无菌水
4．其他试剂与用品
无菌培养皿、无菌移液管、玻璃涂棒、1％重铬酸钾等。 【实验步骤】 一、细菌分离
1．制备土壤稀释液
称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或
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孢子均匀分散，制成102稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备－－－107稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按103……107顺序编号，
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放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml102土壤稀释液，此为103稀释度的土壤
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稀释液，依次操作，制成104、105、106、107的土壤稀释液。
2．涂布分离
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用无菌移液管分别吸取上述107、106、105、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。每个稀释度涂两个平板。
3．恒温培养 将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。 二、放线菌分离
1．制备土壤稀释液
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称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成102稀释度的土壤稀释液。
2．涂布分离
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用无菌移液管分别吸取上述105、104、103、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
3．培养
将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养5～7d后观察结果。 三、霉菌的分离
1．制备土壤稀释液
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称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成102稀释度的土壤稀释液。
2．涂布分离
将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取－－－
104、103、102、三个稀释度菌悬液0.1mL，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
3．培养
将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养3～5d后观察结果。 【思考题】
1． 稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？ 2． 在恒温培养箱中培养微生物时为什么培养皿需倒置？
3 纯培养菌种的菌落、菌体形态观察
【目的要求】
1．学习并掌握观察细菌、放线菌以及霉菌个体形态的基本方法。 2．初步了几种细菌的个体形态以及与其相应的菌落形态特征。
3．通过观察和比较分离出来的细菌以及放线菌及霉菌的菌落特征，掌握初步鉴别上述微生物的方法。 【材料与用品】
上个实验培养出来的各种细菌，霉菌以及放线菌。 【操作步骤】
一、细菌、霉菌、放线菌的培养。（略） 二、菌落形态特征的观察
由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特征及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上的生长状况也不一样。根据微生物的固体培养基上相成的菌落特证，可初步辨别它们的分类地位。观察时，应注意菌落的形状，大小、表面结构、边缘结构、颜色、透明度、气味、黏滞性、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况等。
通常，细菌菌落多为光滑型、湿润、质地软，表面结构及边缘结构特征很多，具有各种颜色。但也有干燥、粗糙的菌落，甚至呈霉状但不起绒毛。
放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基结合紧密，不易被挑取。菌落表面呈粉状或皱褶呈龟裂状，具有各种颜色，正面和背面颜色不同。
霉菌菌落长成绒状或棉絮状，能扩散生长，疏松，很容易挑取。也具有各种颜色，如白色，绿色，灰色等，正面和背面不尽相同。 三、细菌、放线菌及霉菌菌落特征的比较
对分离培养出来的细菌，放线菌及霉菌的菌落特征仔细观察，并将上述三种微生物进行比较，做仔细记录。
四、细菌、放线菌及霉菌菌体形态的观察 对细菌和放线菌进行简单染色，对霉菌不做染色直接制片，观察这三种微生物的菌体形态。
【实验结果】 填写下表 菌落特征 形状 颜色 质地 表面光泽 名称 细菌 放线菌 霉菌 与培养基结合程度 菌体形态 思考题
1． 菌落干燥与湿润的原因是什么？
2． 具有鞭毛、荚膜的细菌在它们形成菌落时，一般会有哪些相应的特征？
