(1)RNA提取
1、取出新鲜肝组织，放在液氮中冻存备用。
2、取匀浆器，加入lml的Trizol Reagent，置冰上预冷。 3、取100mg新鲜肝组织，加入到匀浆器中。
4、充分研磨直至无可见组织块，转移到1.5ml EP管中。 (2)两相分离
每lml的Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4C下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的Trizol Reagent试剂的60％。 (3)RNA沉淀
将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 (4)RNA清洗
移去上清液，每lml Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入至少lml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC H2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。 (5)RNA干燥
小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 (6)溶解RNA沉淀
溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40u1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。 (7)测定RNA的质量
1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定：
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(ug/m1)计算公式为：A260×稀释倍数×40 ug／ml。具体计算如下： RNA溶于4u1 DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260=0.21 RNA浓度=0.21×100×40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35u1，剩余RNA总量为：35u1×0.84 ug/ul=29.4 ug ②纯度测定：
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C，灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25u1溶液。胶凝后将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18m1的37％甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液0.4M MOPS，pH 7.0；0.1M 乙酸钠；0.01M EDTA ②准备RNA样品
取3ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10ug/ml。加热至70C孵育15分钟使样品变性。 ③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5s核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 (8)反转录(枪头和PCR管均经过湿热灭菌，无RNA酶) 1)取一PCR管，加入含2ug RNA的溶液。 2)加入1u1 oligo(dT)15。
3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12u1。
4)于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。
5)依次加入4u1 5×buffer，2u1 10mM dNTPs，1u1 RNA inhibitor和1ul反转录酶，用枪抽吸混匀。
6)于PCR仪上42C保温30min，结束后80C保温5min灭活反转录酶。
定量PCR
1)取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5ul 2.5 uM基因引物 2.0u1 反转录产物 2.0 u1 ddH20 8.5u1
2)取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5u1 2.5uM内标引物 2.0u1 反转录产物 2.0u1 ddH20 8.5u1 3)PCR扩增
预变性 95℃，lmin 循环(40次) 95℃-15s；58℃-20s；72℃-20s 末段延伸 72℃ 5min
溶解曲线 72℃-95℃，每20s升温1℃ 3．数据处理 △△CT法：
A=CT(目的基因，实验样本)一CT(内标基因，实验样本) B=CT(目的基因，对照样本)一CT(内标基因，对照样本) K=A-B 表达倍数=2-K
