第17章 厌氧菌
一、教学大纲要求
（1）厌氧菌的概念、种类及其在人体中的分布特点。 （2）厌氧菌感染的特点，厌氧菌感染的临床及细菌学指征。
（3）厌氧菌标本采集与送检的要求及方法，厌氧菌的检验程序，厌氧培养方法。 （4）无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌感染中的意义、常见种类、细菌学特性与细菌检验方法。 （5）梭状芽胞杆菌属常见致病菌种（破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌）的细菌学特性、致病特点与细菌检验方法。艰难梭菌在引起抗生素相关性肠炎中的意义。
二、教材内容精要
（一）厌氧菌的概念、特点及临床意义
厌氧菌（anaerobic bacteria）是一大群必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。具有以下特点： （1）种类多。厌氧菌分为芽胞厌氧菌和无芽胞厌氧菌两大类。前者只有一个菌属，即梭状芽胞杆菌属，共有100多个种；后者有40多个菌属，300多个种和亚种。
（2）分布广。在正常人体的皮肤以及所有与外界相通的腔道如口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等的黏膜上均有大量厌氧菌寄居。除梭状芽胞杆菌能以芽胞的形式在自然界长期存活外，绝大多数厌氧菌存在于人和动物体内，与需氧菌、兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，并且在种类和数量上占绝对优势，如在结肠中，厌氧菌与需氧菌或兼性厌氧菌的比例为1000:1，即厌氧菌占结肠细菌的99.9%。
（3）感染可发生于人体的各个部位，遍及临床各科。在临床厌氧菌感染中，内源性感染多于外源性感染；由无芽胞厌氧菌引起的感染多于芽胞厌氧菌的感染；混合感染多于单纯厌氧菌感染。
（4）主要临床及细菌学指征：①感染局部有气体产生；②发生在黏膜附近的感染；③深部外伤；④分泌物恶臭或为暗血红色或出现红色荧光；⑤某些抗生素治疗无效的感染；⑥标本直接镜检见细菌染色不均、呈明显多形态；或镜检查见细菌，而需氧培养无细菌生长。
（5）厌氧菌感染的原因：局部组织的氧化还原电势降低，形成有利于厌氧菌生长的厌氧微环境；机体免疫功能下降及屏障作用破坏；菌群失调或厌氧菌的寄居部位发生改变等。
（二）厌氧菌的实验室检查
1. 临床标本厌氧菌的检验程序（图17-1）。
兼性厌氧菌
需氧培养 厌氧培养
厌氧培养
2～7d
确定厌氧菌 （耐氧试验）
每个平板挑5个以上不同菌落 每个菌落接种2个平板，经48h培养 肉眼观察及 直接涂片检查
临床标本
分离培养 (非选择性及选择性厌氧培养基)
增菌培养 (液体培养基)
生长
无生长 生长
专性厌氧菌 菌种保存
菌落特性
分类鉴定
药物敏感试验
形态与染色 生化反应
药敏性鉴定 气液相色谱
图17-1 临床标本厌氧菌检验程序
2. 厌氧菌标本采集时须注意：标本不应被正常菌群污染，应尽量避免接触空气，标本采集后应尽快送检，避免标本干燥。
3. 直接检查对厌氧菌的检验非常重要。通过标本的性状及标本中细菌的形态染色性等，有助于厌氧菌的初步识别（表17-1），便于选择合适的培养基和培养方法。同时，直接镜检还可以验证培养结果的成功与失败。
表17-1 厌氧菌的初步识别
菌 名
脆弱类杆菌 产黑色素普雷沃菌 具核梭杆菌 坏死梭杆菌 韦荣球菌 消化链球菌 乳酸杆菌
革兰染色 G-b G-b G-b G-b G-c G+c G+b
形态及其他特征
两端钝圆着色深，中间色浅不均匀如有空泡，长短不一，标本有琥珀味 球杆菌、可见多形性，长短不一，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭 菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味 菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形 极小的革兰阴性球菌
球形或卵圆形，成双或短链状排列的小球菌，易染成阴性 细长，无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味
痤疮丙酸杆菌 放线菌 破伤风梭菌 产气荚膜梭菌
G+b G+b G+b G+b
菌体微弯呈棒状，一端圆一端渐细，呈X、Y、V或栅状排列，标本有丙酸气味 分枝呈棒状、X、Y、V或栅状排列，脓汁中有硫磺颗粒，呈琥珀酸气味 细长、鼓槌状，芽胞圆形，位于顶端，有鞭毛
粗大杆菌，单个或成双排列，有芽胞（不易看见），有荚膜
艰难梭菌 粗长杆菌，芽胞卵圆形或长方形，位于次极端 G+b
注：G+c， 革兰阳性球菌；G+b，革兰阳性杆菌；G-b，革兰阴性杆菌；G-c，革兰阴性球菌
4. 厌氧菌的分离培养包括初代培养和次代培养（耐氧试验）。初代培养一般应在48h后观察结果，如疑为放线菌则应延长至72～96h。常用于厌氧菌分离的非选择培养基是以牛心脑浸液或布氏肉汤为基础的强化血琼脂平板。选择培养基主要有类杆菌胆汁七叶苷琼脂平板（BBE，用于脆弱类杆菌）、卡那万古冻溶血琼脂平板（KVLB，用于产黑色素普雷沃菌）、卵黄琼脂平板（EYA，用于产气荚膜梭菌）、FS培养基（梭杆菌选择培养基）、VS培养基（韦荣球菌选择培养基）、CCFA培养基（艰难梭菌选择培养基）等。
厌氧菌培养的常用方法有厌氧罐培养法、厌氧气袋法和厌氧手套箱培养法。厌氧罐培养法具有设备简单、操作方便、所占空间小等优点，是目前国内普遍采用的方法；厌氧气袋法简便易行，携带方便，尤其适合床边接种和基层医院使用；厌氧手套箱是目前国际上公认的厌氧菌培养的最佳设备。但耗气量大，适用于大量培养。
5. 厌氧菌一般依据菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定，最后鉴定必须依靠生化反应及终末代谢产物等项检查。
由于厌氧菌生长缓慢，目前常用胞外酶试验进行厌氧菌的快速鉴定。其原理是利用厌氧菌在代谢过程中产生的酶与少量的生化基质迅速反应，不需要厌氧培养，只需用浓菌液即可，并能在4h观察结果。 厌氧菌在代谢过程中能产生较多的挥发性短链脂肪酸、非挥发性有机酸及醇类等代谢产物，并且其代谢产物的种类和含量因菌种不同而异。利用气相色谱技术检测厌氧菌的代谢产物，不仅可用于纯菌的鉴定，还可用于直接分析临床标本中的厌氧菌，具有快速简便、准确可靠、样品用量少、经济等优点，已成为厌氧菌鉴定及分类的重要手段之一。
（三）梭状芽胞杆菌属
梭状芽胞杆菌属（Clostridium）简称梭菌属，是芽胞厌氧菌惟一的菌属。常见细菌有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌。大多数为严格厌氧菌。多数为腐生菌，少数致病菌能产生强烈外毒素，引起人和动物疾病。除艰难梭菌引起的伪膜性肠炎为内源性感染外，其余大多数为外源性感染。
1. 破伤风梭菌（C. tetani）
（1）细菌特性 革兰阳性杆菌，有周鞭毛，无荚膜。芽胞圆形，直径大于菌体，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。专性厌氧，菌落边缘不齐、周边疏松呈羽毛状，常呈扩散生长，不易获得单个表面菌落。不分解糖，对蛋白质有微弱的消化作用。
（2）临床意义 破伤风梭菌是破伤风的病原菌，主要致病物质是破伤风痉挛毒素，为神经毒素，能阻止运动神经细胞释放抑制性神经介质，使肌肉活动的兴奋与抑制失调，造成麻痹性痉挛。
（3）鉴定要点 革兰阳性呈典型鼓槌状；在血琼脂平板上呈迁徙生长，可被特异性抗毒素血清抑制；不分解糖类和蛋白质；动物保护试验阳性。
2. 产气荚膜梭菌（C. perfringens）
（1）细菌特性 革兰阳性粗大杆菌，无鞭毛，有荚膜。芽胞呈椭圆形，直径小于菌体，位于菌体中央或次极端，但在组织和培养基中很少形成芽胞。厌氧菌，但要求不严格。在血琼脂平板上多数菌株有双层溶血环；在卵黄琼脂平板上，出现Nagler反应；在牛乳培养基中有“汹涌发酵”（stormy fermentation）现象。能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖，产酸产气；液化明胶，产生H2S，卵磷脂酶试验阳性。主要代谢产物为乙酸和丁酸。
（2）临床意义 产气荚膜梭菌是临床标本中最常见的厌氧芽胞梭菌，能产生多种外毒素和侵袭性酶类。外毒素有12种，以α毒素（卵磷脂酶）最重要，在气性坏疽的形成中起主要作用；少数菌株能产生肠毒素，通过污染食物（主要为肉类食品）引起感染性食物中毒；β毒素可引起肠黏膜出血性坏死，引起人类坏死性肠炎。
（3）鉴定要点 革兰阳性粗大杆菌，缺少芽胞，有荚膜；血琼脂平板上出现双层溶血，牛乳培养出现“汹涌发酵”现象；卵磷脂酶试验和Nagler试验阳性；动物毒力试验和保护试验阳性。
直接涂片检查对气性坏疽的快速诊断极有价值。如镜检见革兰阳性大杆菌并伴有其他杂菌，白细胞少且形态不典型，即可初步报告。对产气荚膜梭菌引起的食物中毒，在分离培养的同时还须作定量培养，如产气荚膜梭菌大于105/g食品或大于106/g粪便，即可确定诊断。
3. 肉毒梭菌（C.botulinum）
（1）细菌特性 革兰阳性粗大杆菌，有周鞭毛，无荚膜。芽胞呈卵圆形，直径大于菌体，位于次极端，使细菌呈汤匙状或网球拍状。严格厌氧。除G型外，各型均发酵葡萄糖和麦芽糖，不发酵乳糖；液化明胶，产生H2S，脂酶试验阳性。
（2）临床意义 致病物质为肉毒毒素，是已知最剧烈的毒素，为神经毒素，能抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放，导致肌肉弛缓性麻痹。所致疾病主要为肉毒中毒（毒素性食物中毒，一般无胃肠道症状），也可致婴儿肉毒病（感染性食物中毒）。
（3）鉴定要点 革兰阳性粗大杆菌，芽胞卵圆形，大于菌体，位于次极端，细菌近极端芽胞，呈汤匙或网球拍状，脂酶阳性，肉毒毒素测定试验阳性。
肉毒中毒的诊断主要依据肉毒毒素的检出，单纯分离出细菌意义不大。在怀疑为婴儿肉毒病的粪便中检出本菌，并证实可产生毒素，则诊断意义较大。
4. 艰难梭菌（C.difficile）
（1）细菌特性 革兰阳性粗长杆菌，芽胞为卵圆形，位于菌体的次极端。无荚膜，有些菌株有周鞭毛。严格厌氧，对氧极为敏感。在厌氧血琼脂平板上形成较大、粗糙、不溶血的菌落。在环丝氨酸-头孢甲氧霉素-果糖卵黄琼脂（CCFA）平板上，形成表面粗糙、边缘不齐的黄色菌落，在紫外线照射下，可见黄绿色荧光。发酵葡萄糖、果糖和甘露醇，产酸，不发酵乳糖、蔗糖和麦芽糖。不分解蛋白质，不产生吲哚和H２S，不凝固牛奶，不产生卵磷脂酶和脂酶。
（2）临床意义 艰难梭菌是人和动物肠道中的正常菌群，在幼儿的粪便中最常见。长期口服某些抗生素，尤其是氯林可霉素之后，该菌在肠道中过度繁殖并产生毒素而致病，是伪膜性肠炎的主要病原菌之一。致病物质主要为外毒素，即毒素A（肠毒素）和毒素B（细胞毒素）。
