种子的扩大培养及污染的检测和判别
摘要 微生物工业发酵过程中，为提高其产率及质量，要采用纯种发酵,因此,
纯种的制备及污染检测是重要的一道工序。种子制备不仅是发酵生产的第一道工 序，而且是重要的工序。本实验主要通过种子的扩大培养及污染的检测和判别，了解种子制备的方法及影响种子质量的主要因素以及发酵染菌的危害。发酵过程中，采用了染色镜检、平板检测以及酶电极检测相结合的方式进行杂菌检测，学习检测发酵污染的基本方法。
关键词 营养琼脂培养基 扩大培养 判别方法
1 引言
种子制备不仅是发酵生产的第一道工序，而且是重要的工序。 从保藏在试管中的微生物菌种，逐级扩大为生产用的种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。我们应根据菌种的生理特性，选择合适的种子扩大培养条件，来获得代谢旺盛、数量足够的种子。若在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物称为杂菌污染，杂菌轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐”，不但浪费了大量原材料，造成严重的经济损伤，而且污染了环境。因此在发酵过程中随时检测杂菌，对减少杂菌污染造成的损失至关重要。种子培养期染菌的危害最大，应严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。 本实验采用染色镜检、平板检测、真菌检测及噬菌体检测的方法来检测是否有杂菌污染。 2 材料与方法 2.1 实验材料
2.1.1 菌 种：大肠杆菌
2.1.2 培养基：（1）活化培养基（斜面培养基）：营养琼脂
（2）种子培养基（g/L）：葡萄糖0.5％，磷酸二氢铵0.1％， MgSO4·7H2O 0.02％，磷酸二氢钾0.1％
2.2 试剂 番红染液 2.2 实验仪器
高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、三角瓶、试 管、接种针、酒精灯、1ml移液管10支、10ml试管10支、20套培养皿 2.3 实验方法
2.3.1 种子的扩大培养 （1）斜面培养基的配制
配制营养琼脂培养基100ml，分装试管，灭菌后摆成斜面 （2）菌种的活化
将大肠杆菌接种于斜面上，37℃培养18h （3）菌种的扩大培养
种子培养基的配制及种子瓶的灭菌； 由斜面菌种转接种子瓶，振荡培养16h 2.3.2 种子污染的检测和判别 （1）显微镜检查
取样：用无菌操作的方法取培养基中的菌落少许（若为液体培养基则用移液管吸取少量培养基）干燥后在显微镜的油镜下观察。
制片、染色：涂布在载玻片上，自然风干后用番红染色1--2分钟，水洗。 用油镜观察：干燥后在油镜下观察。 （2）平板检查
配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板；
取10稀释液涂布平板上，于37℃、28h培养； 观察菌落形态
（3）检测真菌污染：几丁质酶存在于真菌的细胞壁中，而细菌中几乎没有，通过用透明圈法，具体做法就是取菌落提出几丁质粗酶液后在几丁质—PDA培养基上打孔培养一定时间然后观察是否有透明圈，若有透明圈说明有杂菌污染，且杂菌为真菌。
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检测噬菌体污染：在牛肉膏蛋白胨琼脂培平板培养基上加入0.1mL纯种大肠杆菌培养液，涂布平板，静置30min左右待平板上的菌液干后，滴加裂解液（发酵液经过4000r/min离心之后。再37℃过夜培养后的液体）于其上，放置37度培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，证明你的种子或发酵液液中含有噬菌体，大肠杆菌被污染。 2.4 结果
2.4.1 种子的扩大培养
观察到在活化培养基上长出大量菌落，而且菌落颜色单一，均为淡黄色。挑取边缘菌落及形态一致的菌落少量，制作装片，染色后在显微镜下观察，发现多个视野中都为杆菌，可初步得出活化的菌种中没有污染杂菌。挑取没有污染杂菌的菌落，用无菌操作技术接种，进行扩大培养。
在适宜条件下培养16h后，得到了大肠杆菌的种子液，吸取该种子液在显微镜下观察到有大量的大肠杆菌。
2.4.2
图一：显微镜下的大肠杆菌和杂菌（40×10）
镜检时，多个视野中均观察到大肠杆菌，这个视野中观察到球菌，因此认为该大肠杆菌中感染了杂菌。
2.4.2
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图二：平板上的大肠杆菌和杂菌
从营养琼脂培养基长出的菌落的形态上看，可观察到有不同形态的菌落，说明菌液中污染了杂菌。 3 讨论
通过本实验我们了解了种子的制备方法以及发酵染菌的危害，也学会了判别发酵染菌的基本方法。在生产中，染菌不仅浪费大量原材料，造成严重的经济损失，而且污染了环境。所以，在种子活化培养和扩大培养中每一步均需进行无杂菌检查。染色镜检可以直接检查杂菌污染，在检查时注意区分固形物和菌体，一般经单染色后，菌体着色均匀，且有一定形状；固形物无特定形状，着色浅或不着色。平板检测是间接检测杂菌污染，方法较为简单直观，但是，所需时间长，而且无法区分形态与生产菌相似的杂菌。在污染初期，生产菌占绝大部分，污染菌数量很少，所以要做比较多的平行试验才能检出污染菌。
参考文献
[1]吴根福.发酵工程实验指导，2005，5（1）：46～48.
[2]全国食品发酵标准化中心，中国食品工业标准汇编，北京：中国标准版社， 2000
[3]姚汝华，发酵工程工艺原理，广州：华南理工大学出版社，1996 [4]李艳，发酵工程概论，北京：中国轻工业出版社，1999 [5]陈坚，发酵工程实验技术，北京：化学工业出版社，2003 [6]沈萍，陈向东.微生物学实验（第四版），高等教育出版社，2007
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