20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。在
M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。
1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上；(2)制备含突变基因的M13DNA单链模板；(3)引物与模板与模板退火，5/端磷酸化的突变寡核苷酸引物与待突变的寡核苷酸引物与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA (4)合成突变链，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补连，而后由连接酶封
闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子； (5)转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型，突变型的同源双链DNA分子，可以用限制性酶切法，斑点杂交法和生物来初步筛选突变的基因； (6)对突变体基因进行序列分析。
2.改进型双引物诱变原理是将目的基因克隆到M13噬菌体载体中，提取M13单链DNA，作为PCR的模板；设计两个引物，这两个引物分别与M13同一条单链的不同DNA片段互补，其中一个引物（引物1）与目的基因的一部分互补，但是含有一个核苷酸的突变；另一个引物（引物2）中含有一个酶切位点，但该酶切位点的一个核苷酸被诱变。对引物1的5/端进行磷酸化，引物2的新生链的3/端与引物1的磷酸化后5/端相遇，两端DNA在T4DNA连接酶的作用下连接。这样引物1的磷酸二酯键起到封接作用，保护引物1不会被新生连所替换。用未被引物2诱变时的限制性内切酶位点所对应的限制性酶解PCR产物，然后用该酶解产物转化修复缺陷型大肠杆菌。由于不含有引物2诱变的DNA都被切割成线性，不能在大肠杆菌中稳定存在，所以得到的转化子都是同时含有1.2两个突变位点的。通常引物2选择在抗性基因中，这样除用限制煤排除非突变体外，还可以抗性变化来进行进一步筛选。这种方法较为简便易行，且得到突变体的机会较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。
二、定点诱变在蛋白质工程中的应用的举例 1.加入二硫键增加蛋白质的稳定性
蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（－SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（－Ｓ－Ｓ－）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性.
2.将天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)转换成其他氨基酸 当蛋白质暴露于高温时:
天冬酰胺（Asn） 天冬氨酸(Asp) + NH3 谷氨酰胺(Gln) 谷氨酸(Glu) + NH3 导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。
如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶活性也大为降低；而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰期则延长。 3.减少游离Cys残基的数目
在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即
