左右）占了绝大部分，mRNA的数量仅占总RNA的很少一部分（2%左右），但mRNA的种类是最多的，rRNA种类最少，tRNA种类介于两者之间。 ③ tRNA的二级结构是类似三叶草形的结构，具有四环四臂，其中氨基酸接受臂（末端具有CCA）负责与氨基酸结合，二氢尿嘧啶臂与二氢尿嘧啶环（D环）相连，反密码子臂与反密码子环相连，反密码子环上具有反密码子，负责与mRNA上的密码子识别，TΨC臂与TΨC环相连，另外还有一个可变环（不同tRNA的长短不同）。 ④ tRNA的三级结构类似倒写的L，其中反密码子和氨基酸接受臂暴露在外面。 ⑤ mRNA一级结构上有哪些明显的特征：5’端的帽子结构（与核糖体的识别有关）和3’端的多聚腺苷酸尾（PolyA尾，与mRNA的寿命有关），位于两者中间的是编码蛋白质的区域（编码区）。 ⑥ 除了上述三种RNA外，还存在其它类型的RNA，具不同的生物学功能（往往不负责蛋白质合成）。 7 核酸的性质
? 核苷酸的解离性质
核酸同核苷酸一样，核酸具有两性解离的特点，因此具有等电点。DNA的等电点大约为4-4.5，RNA的等电点大约为2-2.5。 ? 核酸的水解
组成核酸的核苷酸残基之间的磷酸二酯键可以被酸、碱或核酸水解酶水解，得到较短的核酸链或核苷酸。按底物类型可将其分为核糖核酸酶（RNase，用以切割RNA）和脱氧核糖核酸酶（DNase，用以切割DNA）。如果水解的磷酸二酯键位于核酸链的内部，该酶称为内切核酸酶，如果从核酸的末端（3’端或5’端）水解核酸，则称为外切核酸酶（即3’→5’外切核酸酶或5’→3’核酸外切酶）。 ? 核酸的光吸收性质
核酸在260nm处具有特征光吸收，产生光吸收的原因是构成核酸的核苷酸的光吸收性质。实验中，可以跟据样品溶液在260nm处的光吸收值对其中所含DNA或RNA进行定量分析和纯度分析。比如，对于纯的DNA样品，其OD260/OD280应为1.8，而对于纯的RNA样品，其OD260/OD280应为2.0，如果DNA样品的OD比低于1.8，表明含有蛋白质或其它杂质，如果大于1.8，表明含有RNA杂质。纯的样品中，1OD260相当于双链DNA浓度为50 μg/mL，单链DNA或RNA浓度为40μg/mL。 ? 核酸的变性与复性 ① 什么是核酸的变性？变性后核酸性质的变化。 ② 什么是Tm值？影响Tm的因素有哪些？ ③ 什么是核酸的复性？影响Tm的因素有哪些？
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? 核酸的溶解性
① 核酸是白色固体，易溶于水，如果加入钠盐会增大核酸在水中的溶解度。分子生物学实验中往往用pH8.0左右的TE溶液溶解核酸。 ② 什么是分子杂交？Southern杂交、Northern杂交和Western杂交。 ? 核酸的序列测定 ① 掌握链终止法测定DNA序列的原理。 ② 了解焦磷酸测序技术的原理。
第11章 维生素和辅酶 1 维生素定义、分类与特点 ? 维生素的定义和特点 ① 维生素是维持机体正常生长和健康所必需的一类低分子有机化合物。 ② 特点：既不是构成动植物组织的材料，也不是供能物质；需要量有限 ；大多数B族维生素构成辅酶，参与物质代谢。 ③ 人体和高等动物体每天需要的维生素的量很少，是以毫克或微克计的，且必需由食物提供。 ? 维生素的分类 ① 依据维生素的溶解性，将其分为两类：水溶性维生素和脂溶性维生素。 ② 水溶性维生素主要包括维生素C和维生素B族。特点是易溶于水，不溶于有机溶剂，往往是作为代谢酶的辅酶或辅基起作用，在动物肝脏中含量丰富，但在体内往往不积累，超出量时则随尿液排出体外。 ③ 脂溶性维生素主要有维生素D、A、K、E等。特点是易溶于有机溶剂，不溶于水，主要存在于动物肝脏中，各自具有不同的生物学功能。 ? 维生素缺乏症
由于机体缺乏维生素引起物质代谢发生障碍而引起的疾病。由于不同维生素的生理功能不同，因此缺乏时所引起的病也各不相同。 2 脂溶性维生素 ① 维生素A
维生素A又称视黄醇，是一个具有脂环的不饱和一元醇，通常以视黄醇酯的形式存在。结构：脂环为β-白芷酮环。维生素A的化学结构与β –胡萝卜素的结构相关。
功能：维持上皮组织的健康、维持正常视觉、刺激组织生长及分化。
来源：存在于动物性食物中，鱼肝油中含量较多。维生素A1和A2来源不同。维生素A1存在于咸水鱼的肝脏，而维生素A2则存在于淡水鱼的肝脏。另外还有维生素A原，即β-胡罗卜素。植物性食物中仅含β-胡罗卜素（被酶催化断裂产生两分子视黄
醇），不含维生素A。 ② 维生素D
维生素D：是一类维生素的总称，其中最重要的成员是麦角钙化醇（VD2）和胆钙化醇（VD3）。
维生素存在部位：主要含于肝、奶及蛋黄中，以鱼肝油含量最丰富。
主要作用：抗佝偻病、软骨病和手足抽搐症。 维生素D在体内的转化：小肠（吸收） → 肝（转化为25-羟维生素D3） → 肾（转化为1,25-二羟维生素D3,即其活性形式）→小肠（促进Ca2+和P的吸收）。 ③ 维生素E
一类与动物生育有关的维生素，主要存在于植物油中，尤其以麦胚油、大豆油、玉米油和葵花籽油中含量最为丰富。
天然的维生素E共有8种，在化学结构上均为苯骈二氢吡喃的衍生物。分为生育酚和生育三烯酚两类。 维生素E的生物学功能
1、与动物生育有关：动物缺乏维生素E时，其生殖器官受损而不育。
2、作为抗氧化剂：与硒协同通过谷胱甘肽发挥抗氧化功能。
3、促进血红素的生物合成：提高血红素合成过程中关键酶-氨基-酮戊酸合成酶和ALA脱水酶的活性。 ④ 维生素K
维生素K：天然维生素K有两种。在植物绿叶和动物肝脏中含量丰富。
维生素K的功能：促进肝脏合成凝血酶原，并调节另外三种凝血因子的合成。 3 水溶性维生素 ① 维生素C
维生素C：又称抗坏血酸（因其具有防治坏血病的功能）。是一种含6个碳的酸性多羟基化合物
维生素C的功能：? 参与体内的氧化还原反应（保持巯基酶的活性和谷胱甘肽的还原状态，起解毒作用；与红细胞的氧化还原过程有密切关系；促进肠道内铁的吸收，将血浆中的三价铁还原成二价铁；保护维生素A、E、B等免遭氧化）。? 参与体内多种羟化反应（促进胶原蛋白的合成；与胆固醇代谢有关；参与芳香族氨基酸代谢）。? 其他功能（防止贫血；改善变态反应；刺激免疫系统）。 ② 维生素B1
维生素B1：又称硫胺素，是由含硫的噻唑环和含氨基的嘧啶环组成。在生物体内以硫胺素焦磷酸（TPP）的辅酶形式存在。另外，具有抗脚气病作用，又称为抗脚气病维生素。
TPP是糖代谢中羧基碳（醛和酮）合成与裂解反应的辅酶。
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③ 维生素PP
维生素PP：包括烟酸和烟酰胺。属于吡啶衍生物。广泛存在于酵母、花生、谷类、豆类、肉类和动物肝中，生物体内色氨酸能转变为维生素PP。
功能：形成辅酶，参与能量代谢过程。烟酸与核糖、磷酸、腺嘌呤组成脱氢酶辅酶NAD+和NADP+。 ④ 维生素B2 维生素B2：又名核黄素，是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物。有氧化型和还原型两种形式。在生物体内氧化还原过程中起传递氢的作用。 在体内核黄素是以黄素核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在的，二者都是氧化还原反应中常见的氢载体。 ⑤ 维生素B6
维生素B6：包括3种物质，即吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺，都是吡啶衍生物。在体内以活性形式磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺存在。
磷酸吡哆醛参与催化涉及氨基酸的各种反应，包括转氨作用、脱羧作用、消旋作用等。 ⑥ 泛酸 泛酸：又名遍多酸，是由β-丙氨酸通过肽键与α、γ-二羟基丁酸缩合而成的一种有机酸。
泛酸是辅酶A（CoA）和磷酸泛酰巯基乙胺的组成成分，辅酶A是其主要活性形式，主要作用是传递酰基。其中辅酶A的主要作用有两个：一是通过亲核攻击转移活化的酰基；二是吸取一个质子活化酰基的α-氢。 ⑦ 维生素B12 维生素B12：又称氰钴胺素，在体内转化为2种辅酶，主要辅酶形式是5’-氧腺苷钴胺素。 维生素B12辅酶参与3种类型的反应：
分子内重排；核苷酸还原成脱氧核苷酸；甲基转移。 ⑧ 生物素
生物素：是由噻吩环和尿素结合而成的一个双环化合物，左侧链上有一分子戊酸。
生物素在酶促羧化反应作为活动羧基载体。
生物素在肝、肾、蛋黄、酵母、蔬菜和谷类中含量较高。肠道细菌也能合成供人体需要。 ⑨ 叶酸
叶酸和四氢叶酸：叶酸最初由肝中分离出来，后发现在绿叶中含量丰富，故名叶酸。它是由2-氨基-4-羟基-6-甲基喋啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸三部分组成，所以又称蝶酰谷氨酸。
叶酸是所有氧化水平碳原子一碳单位的载体（除二氧化碳）。四氢叶酸是叶酸的活性辅酶形式。 ⑩ 硫辛酸
硫辛酸是一种酰基载体，存在于丙酮酸脱氢酶和α-
酮戊二酸脱氢酶中，硫辛酸在其中起偶联酰基转移和电子转移的功能。
硫辛酸在丙酮酸脱氢酶系中的作用：酰基转移和电子转移。
第8章 酶通论 一、酶催化作用的特点
1、酶作为生物催化剂的特点：易失活；具有很高的催化效率；具有高度专一性；其活性受到调节和控制。酶的特点与酶的什么性质或结构特点有关系。 2、什么是转换数（TN）？它用来表示什么？掌握转换数的计算。
3、酶活性受到哪些因素的调节？温度、pH等。 二、酶的化学本质及其组成
1、大多数酶的化学本质是蛋白质。核酶的定义。 2、酶的空间结构是维持其生物学功能（生物催化）所必需的，若组成酶的蛋白质成分变性或解离成亚基，则酶失活。 3、酶按照化学组成可分为哪两类？各有什么样的特点？尽量能举出一两个例子。
4、复杂酶中的非蛋白质成分称为辅助因子（包括金属离子、辅酶或辅基），而酶中的蛋白质成分称为脱辅基酶（脱辅基蛋白）。辅酶与辅基的区别是什么？ 5、什么是全酶？全酶包括哪几部分？ 6、根据酶蛋白分子的特点可将酶分为哪3类？各有什么特点？
三、酶的分类与命名
1、酶的国际系统分类法所涉及的6大类酶包括哪些？要求能对典型反应所属的大类进行准确判断。比如β-D-葡萄糖与氧气反应，生成葡糖酸的反应，属于氧化还原反应，由属于氧化还原酶类的葡糖氧化酶催化完成。
2、传统的酶命名方法一般依据两个原则：根据酶作用的底物命名；根据酶催化反应的性质及类型命名。要求能准确由酶的习惯名称判断其可能的底物。 四、酶的专一性
1、酶专一性的类型有哪几种？各有什么特点？ 2、给定一个酶，能根据其催化特点确定其专一性。 3、酶专一性的假说：诱导契合学说。
4、绝对专一性的酶其底物只有一种；相对专一性的酶，可能有一种以上的底物。
比如脲酶具有绝对专一性，它只能作用于一种底物（尿素）；已糖激酶具相对专一性，它既可以作用于葡萄糖，也可以作用于果糖（即有两种以上的底物）。 五、酶的活力测定和分离纯化 1、什么是酶活力？酶活力的大小一般用什么表示？ 2、酶活力单位是怎样定义的?
3、什么是比活力？比活力的大小表明什么？
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4、掌握酶活力、比活力、回收率的计算。 六、核酶和抗体酶 1、什么是核酶？
2、有些核酶是核酸与蛋白质构成的复合物，那么，其中起催化作用的是哪种成分？ 3、什么是抗体酶？抗体酶与一般的酶有什么不同？
第9章 酶促反应动力学
一、底物浓度对酶反应速率的影响 1、什么是酶催化的中间复合物学说？该学说是否已被实验证实？如果已被证实，有哪些证据？
2、米氏方程：米氏方程的方程式、Km（米氏常数）和Vm（最大反应速率）的含义。
v?Vm?[S]
Km?[S](1) Km是酶的一个特征常数，它的大小只与酶的性质有关，与酶浓度无关。Km随底物、反应的温度、pH值和离子强度而改变（这些都会影响到酶的性质）。底物浓度改变不会影响Km值，所以我们可以利用不同底物浓度下的反应速率来测定Km值。而在测定时，一定要求一定条件下（即离子强度一定，pH值一定，温度一定，底物固定）。
(2) 催化同一底物的不同酶具有不同的Km值，一般Km最小的酶是催化效率最高的，所在有多各可供选择的酶的情况下，优先选择Km值小的酶进入实验。 (3) 同一种酶有时可以催化多种底物反应，其Km值也是不同的。当该酶作用于某一底物时，如果其Km最小，则称这种底物为该酶的最适底物（或称天然底物）。所以反过来，1/Km的数值大小表明酶对底物亲和力的大小，1/Km越大，表明亲和力越大（因为1/Km越大，则Km越小，即达到最大反应速率一半所需的底物浓度越小），很显然，最适底物的Km最小，亲和力最大。
(4) Km值的物理意义：是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L（或与底物浓度单位一致）。即当底物浓度[S]=Km时，v=Vm/2(由米氏方程导出)。
由此推导，可以在已知某酶Km的情况下，计算某一底物浓度下的酶促反应速率相当于最大反应速率的百分数。如当底物浓度[S]=4Km时，v=Vm·4Km/(Km+4Km)=0.8Vm。
(5) 当[S]< 当[S]>>Km时，即底物浓度远大于米氏常数时（底物过量），米氏方程可转变为v=Vm。 即当底物浓度足够大时，反应达到最大速率。这时所有酶均被底物饱和，反应速率达到最大值，不再随[S]的变化而变化。此时，酶促反应的速率与酶浓度呈正比关系。 (6) Km的定义式为Km?k2?k3，k1、k2和k3对k1应于单酶底物中各反应过程。所以在谈到米氏常数或米氏方程的时候，一定要联系该方程推导的前提，中间复合物学说和反应达到平衡态（稳态）。 当式中k3< (7) 当一代谢途径反应如下： A→B→C→D。。。 则催化这三步反应的酶的Km分别为a1、a2和a3，则比较这三个值的大小，可以判断哪步反应是该代谢途径的限速步骤。 反过来讲也是一样的，比如糖酵解途径中，催化的反应（果糖-6-磷酸→果糖-1,6-二磷酸）的酶果糖磷酸激酶的Km比其它所有反应的Km值要低，所在该酶所催化的反应是糖酵解途径的限速反应。 (8) Vm和k3(kcat) 在一定条件下（一定pH、温度、底物、离子强度等）Vm也是一个常数，它不随底物浓度的变化而变化。由前面的推导可知，当底物浓度很大时，酶促反应达到最大速率Vm。而根据 （6）中的反应式可知，Vm=k3[E]，即此时最大反应速率与酶浓度成正比，其斜率为k3，也就是形成产物的反应的速率常数。k3是当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫作转换数（TN），通常称为催化常数（即前一章提到的转换数）。其值越高，表明酶的催化效率越高。 (9) 米氏常数的测定（双倒数作图法） 给定一组实验数据，根据实验数据或自己测定的结果可以利用双倒数作图法求出所用酶的米氏常数和最大反应速率。 3、多底物反应的机制分类：序列反应（有充反应和随机反应）和乒乓反应。 谷草转氨酶催化的多底物反应属于乒乓反应。 两个底物：谷氨酸和草酰乙酸 12 两个产物：α-酮戊二酸和冬氨酸 二、酶的抑制作用 1、抑制作用的类型 不可逆抑制作用和可逆抑制作用。 不可逆抑制作用：抑制剂与酶以共价键相连，使酶活力丧失，不能通过透析、超滤等手段解除抑制。 可逆抑制作用分为3种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。 竞争性抑制剂与底物竞争酶分子上的结合位点，从而干扰酶与底物的正常结合，从而影响酶的活性。这一类抑制剂往往是底物的类似物。 竞争性抑制剂作用的结果，Vm不变，Km增大，相当于降低了酶与底物的亲和力。 非竞争性抑制剂不与底物竞争结合位点，而是结合于底物结合位点之外的位点，因此与底物没有竞争关系，结合后形成酶-底物-抑制剂三元复合物，不能进一步分解形成产物，从而抑制酶的活性。 非竞抑制剂作用的结果，Vm减小，Km不变。 反竞争抑制剂在底物与酶结合后与酶-底物复合物结合，常见于多底物反应中。 反竞争抑制剂作用的结果，Vm减小，Km减小。 2、了解各种抑制剂及其作用原理 三、温度和pH值对酶活性的影响 1、什么是最适温度？什么是最适pH？ 2、能看懂温度和pH对酶促反应速率的影响（曲线）。 3、不同酶的最适温度不同，一般人体内各种酶的最适温度接近37℃，而某些嗜热菌的酶最温度可达90℃甚至更高。体内不同酶的最知pH不同，胃蛋白酶的最适pH为1.5；而精氨酸酶的最适pH达9.7。大多数酶的作用在近中性环境中进行。 4、温度如何影响酶的活性： 在达到最适温度之前，温度升高，反应速率增高（用反应的温度系数表示）；到达最适温度后，温度进一步升高，则酶活性下降。 温度影响酶活性主要是过高的温度会使蛋白质变性，从而使酶失活。 5、pH值如何影响酶的活性： pH值的改变可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象改变，酶活性丧失； pH改变不很剧烈时，酶活性受到影响：pH值的改变可以影响底物的解离状态、影响酶分子上活性部位的解离状态、使底物与酶不能正常结合，或结合后不能形成产物、影响酶分子上催化部位的解离状态，从而影响催化活性、pH值改变引起酶蛋白构象发生变化，进而影响酶的活性。 pH改变过于剧烈时，酶蛋白分子发生变性而沉淀，从而完全失活。
