SOP-FF-9-002-C 紫外一可见分光光度法标准操作规程 - 图文

SOP-FF-9-002-C 紫外一可见分光光度法标准操作规程 第 5 页 共 8 页 在规定的波长(参见5.8项)测定其吸光度，并计算吸收系数，应符合规定范围。 4.2 鉴别及检查 按各品种项下的规定，测定供试品溶液的最大及最小吸收波长，有的并须测定其在最大吸收波长与最小吸收波长处的吸光度比值，均应符合规定。 4.3 含量测定 4.3.1 对照品比较法 按各品种项下规定的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100%±l0%以内，用同一溶剂，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度。 4.3.2 吸收系数法 按各该品种项下配制供试品溶液，在规定的波长及该波长±2nm处测定其吸光度，按各该品种在规定条件下给出的吸收系数计算含量。 用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定，如测定新品种的吸收系数，需按后列“吸收系数测定法”的规定进行。 4.3.3 计算分光光度法 按《中国药典》规定，计算分光光度法一般不宜用于含量测定，对于少数采用计算分光光度法的品种，应严格按各品种项下规定的方法进行。用本法时应注意：有一些吸光度是在待测成分吸收曲线的上升或下降陡坡处测定，影响精度的因素较多，故应仔细操作，尽量使供试品和对照品的测定条件一致，若该品种不用对照品，如维生素A测定法(见《中国药典》附录)，则应在测定前对仪器作仔细的校正和检定。 4.3.4 比色法 供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区。 用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。 当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量 5 注意事项 SOP-FF-9-002-C 紫外一可见分光光度法标准操作规程 第 6 页 共 8 页 5.1 试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。 5.2 使用的石英吸收池必须洁净。当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。 5.3 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装样品溶液以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保存，吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸(3：1V/V)混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。 5.4 含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂臵lcm石英吸收池中，以空气为空白(即空白光路中不臵任何物质)测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度应符合表3规定。 表3 以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定 波长范围(nm) 220-240 241-250 251-300 300以上 吸光度 ≤ 0.40 ≤ 0.20 ≤ 0.10 ≤ 0.05 每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的同批溶剂。 5.5．称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。含量测定时供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份。吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±O.5%以内。作鉴别或检查可取样品1份。 5.6 供试品溶液的浓度，除各品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸光度以在0.3—0.7之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制合适的读数浓度。 SOP-FF-9-002-C 紫外一可见分光光度法标准操作规程 第 7 页 共 8 页 5.7 选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽度的10%，否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供试品溶液的吸光度不再增加为准，对于《中国药典》紫外分光光度法测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但当吸收带的半高宽小于20nm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查则需用lnm缝宽或更窄，否则其264nm的吸光度会偏低。 5.8 测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰±2nm处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位臵是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。 5.9 用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的pH值是否一致，如pH值对吸收有影响，则应调溶液的pH值一致后再测定吸光度。 6 结果计算 6.1 对照品比较法 可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。 c样品=A样品×c对照 /A对照 式中 A为吸光度值；c为测试液浓度(以mg/ml计)。 %6.2 吸收系数法 《中国药典》规定的吸收系数，系指正E11cm，即在指定波长时，光路长度为lcm，试样浓度换算为1%(g/ml)时的吸光度值，故应先求被测样%%品的E11cm值，再与规定的E11cm值比较，可计算出供试样品的含量。 % E11cm（样品）?Ac?l 式中 A为供试品溶液测得的吸光度值； c为供试品溶液的百分浓度，即lOOml中所含溶质的克数(g/m1)； l为吸收池的光路长度(cm)。 %1% 供试样品的含量%= E11cm（样品）/ E1cm100 (标准）×% 式中：E11cm（样品）为根据前式计算出的供试品吸收系数； % E11cm（样品）为药典或药品标准中规定的百分吸收系数。 7 吸收系数测定法 本法主要用于新品种的吸收系数测定。 SOP-FF-9-002-C 紫外一可见分光光度法标准操作规程 第 8 页 共 8 页 7.1 测定方法 取精制样品精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度读数在0.6-0.8之间，臵lcm吸收池中，在规定波长处按5.8项的规定测出吸光度读数，然后再用同批溶剂将溶液稀释1倍，使吸光度在0.3-0.4之间，再按上述方法测定。样品应同时测定2份，同一台仪器测定的2份结果对平均值的偏差应不超过±0.3%，否则应重新测定。测定时，先按仪器正常灵敏度测试，然后再减小狭缝测定，直到减小狭缝吸光值不增加为止，取吸光度不改变的数据。再用4台不同型号的仪器复测。 吸收系数可根据朗伯比尔—定律求算，以下例说明： 已知某化合物的分子量为287，用乙醇配成浓度为0.0030%的溶液，在波长)7nm处，用lcm石英池，测得吸光度为0.6139，求E11cm值及摩尔吸收系数ε值。 E1cm(297nm)?1?l?0.6140.0030?10.6141000100?205?5874 ?1 ?297nm?A?cl0.0030?2877.2 测定注意事项 7.2.1 样品应为精制品，水分或干燥失重应另取样测定并予以扣除。 7.2.2 所用的容量仪器及分析天平应经过检定，如有相差应加上校正值。 7.2.3 测定所用的溶剂，其吸光度应符合规定。吸收池应于临用时配对或作空白校正。 7.2.4 称取样品时，其称量准确度应按《中国药典》规定要求。 7.2.5 所用的分光光度计应经过严格检定，特别是波长准确度和吸光度精度要进行校正。要注明测定时的温度。