人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案 2012级师范2班第3组
组员：吴婵 胡颖月 央珍 杨基伟 杨青松 宋海燕 田金梅（组长）
一、实验目的
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。 二、实验原理
人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：
（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%
（2）臂指数=长臂/短臂 （反映着丝粒位置的指数）
（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）
人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。根据丹佛（1960），伦敦（1963）和芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体长度依次减小和着丝粒位置以及其他特征，把人类体细胞染色体分为七个组群，各自特征简括于表1。
表1 人染色体组型及其特征 组别 A B 染色体序号 1~3 4~5 形态，大小 最大 次大 着丝粒位置 M Sm Sm S他 常见一号 常见九号 无 无 无 次缢痕 随体 鉴别程度 可鉴定 不易 难鉴定 难鉴定 可鉴定 C 6~12+X 中等 D E 13~15 中等 16~18 较小 偶见13号 有 无 16m,17m, 常见16号 18sm F G 19~20 次小 21~22+Y 最小 M St 无 有，Y无 不易 难鉴定
三、实验材料和试剂
1、材料
人的静脉外周血（组内选取男女生各一名，取血样） 2、试剂
完全RPMI-l640培养液（含双抗，小牛血清），肝素溶液（医院采血时已加）,PHA（植物血球凝集素）溶液母液10mg/mL，75%乙醇,秋水仙素溶液母液50ug/mL,Giemsa染液，0.075mol/LKCl溶液，Carnoy固定液，磷酸缓冲液PH6.8；纯酒精，冰乙酸等
3、器材
恒温培养箱,离心机,分析天平,显微镜,超净工作台,移液枪，离心管（8个）,培养瓶（4个）,试管架,量桶（10ml，2个）,烧杯（50ml和25ml各一个）,酒精灯,染缸，胶头滴管（7个），玻璃棒（2根），载玻片（8片）等。 四、实验方法和步骤
（一）各种试剂及培养基的配制
(1)完全RPMI-1640培养基的配制（老师已配好）：称取RPMI-l640培养粉9.8g溶于1,000mL蒸馏水中,经G6型号细菌过滤漏斗中0.22um的滤膜抽滤后，加入小牛血清lmL,肝素3滴（0.03ml）, 双抗5滴（0.05ml）,NaHCO3调pH至7.2～7.4，备用。
(2)PHA(植物血球凝集素)溶液：老师提供10mg/ml的母液 (3)肝素溶液：医院采血时已加
(4)秋水仙素溶液：老师提供50ug/ml的母液 (5)低渗液的配制：称取0.2795gKCl溶于50mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075mol/L的低渗液50ml。
(6)固定液的配制：9ml纯酒精+3ml冰乙酸。 (7)Giemsa（吉姆斯）染液 （全班统一配制）
Giemsa原液：Giemsa粉剂0.8g，甘油50ml，甲醇50ml
配制方法：先少量甘油加入研钵中，将Giemsa粉剂在研钵中充分研磨（40min），再倒入剩余甘油，并在56℃温箱中保温2h，然后加入甲醇，混合摇匀，用有色玻璃瓶密封保存备用。
Giemsa稀释液：临用时，取Giemsa原液1份加9份磷酸缓冲液
（老师提供0.2mol/l的母液，用时稀释一倍）稀释。 （二）实验操作步骤
实验前准备： 器具消毒灭菌 药品配制
Giemsa:1份原液，9份PH为7.4的磷酸缓冲液 卡诺氏固定液：甲醇：冰醋酸=3:1（24h内使用） 培养基添加0.0795ml浓度为10mg/ml的PHA母液 载玻片冰冻处理
超近工作台消毒灭菌 操作人员消毒 实验过程： 1.培养基配制
将4个洁净的培养瓶分别贴上标签“男1”、“男2”和“女1”、“女2”在超净工作台上各取5ml事先准备好的完全RPMI-1640培养液（含双抗和小牛血清）于培养瓶中，再用移液枪各自加入PHA 0.075ml,贴上封口膜。加入PHA。
2． 采血接种
到校医院采静脉血3-4ml，用肝素湿润管壁存放。用移液枪向含有5ml培养基的培养瓶中加入0.3ml全血，接种过后再次用酒精棉消毒瓶塞，并在外面用封口膜密封好，轻轻摇匀。
3.培养
将培养瓶置于37度培养箱中培养72h，终止培养前3-4h加入秋水仙素0.076ml，使最终浓度在0.7ug/ml。培养过程中注意观察，有血凝块时要尽量摇散。
4.收集细胞
将培养瓶从温箱中取出，用吸管轻轻吹打，使细胞混合均匀。以1000rpm/min离心8分钟，去掉上清液。
5.低渗处理
用滴管1向离心管中加入1ml0.075mol/ml的KCL溶液，轻轻吹打使细胞重悬。补加6mlKCL溶液，37度低渗处理20分钟。低渗过程中可吹打一次，帮助低渗完全。
