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蛋白质的测定及其研究与发展
食安1102班 4102110211 刘鑫
引 言
蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。在生物体内，它有很重要的地位，人们常说没有水会死，但没有蛋白质同样会死，所以可想而知它的重要性。正是因为它的重要，人们才需要对它进行研究和探索，即使它的结构相当复杂，还是阻挡不了人们研究它的步伐。
蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命科学最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品、药物、食品质量检测的重要指标。在生化试验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质具有很多理化性质，例如：它的相对分子质量很大、两性电离的特性、它的胶体性质、沉淀反应、变性复性凝固性、紫外吸收、呈色反应、、、、、、
一、测定方法
测定蛋白质的方法有很多种，这些方法都是根据它的理化性质和生物学活性建立起来的。
目前常用的有四种经典的方法：定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法：考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比
紫外吸收法高10-20倍，比Biuret法高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
凯氏定氮法
此方法根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量。公式：每克样品中含氮克数*6.25*100.凯氏定氮法又包括常量、微量、自动、半微量及改良版。
样品与浓硫酸和催化剂共热，含氮有机物即分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品氮的含量。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。 （1）消化
总反应式：2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用98%浓硫酸
1、加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340摄氏度，加入硫酸钾之后可以提高至400摄氏度以上。也可加入硫酸钠、氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
2、加硫酸铜 作为催化剂，还可以作消化终点指示剂，还可以加氧化汞、汞（有毒且价格贵）、硒粉、二氧化钛。
3、加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。 （二）蒸馏
水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶中加入吸收液及指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。 （三）滴定
1、用4%的硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿）
2、用过量的硫酸或盐酸标准溶液吸收，再用氢氧化钠标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红作指示剂。
此方法的优点:由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。缺点：此法有环境污染，适用于0.2-1.0mg氮，误差为2%，
费时8-10小时，将氮转化为氨，用酸吸收后滴定。
Biuret法
蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。但此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2N-CH=NH或-CH2-NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。
主要试剂：溶解1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠于500ml水中，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中。此试剂可长期保存，以备使用。
但该方法灵敏度低，所能测定的蛋白质浓度范围仅仅为1-10mg/L,因此每次实验所需的样品量都比较大。但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。
Lowry法
此法是双缩脲法的进一步发展，它的第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂，结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，实用于测定20mg/L~400mg/L含量的
