就是把酶结合到一种水不溶的固体载体上，根据结合的方式不同又可分为下列几种方法。 1物理吸附法 ○
无机载体，如高岭土、硅胶、氧化铝、活性炭、羟基磷灰石等。
有机载体，如纤维素、合成树脂、骨胶原、淀粉等。吸附容量比无机载体高。 2离子结合法 ○
离子结合法是指在适宜的pH和离子强度条件下，酶通过离子键结合到具有离子交换基的水不溶性载体中的固定化方法，因而也称离子交换吸附法。
物理吸附法的优点是：利用此法进行固定化，酶的活性中心不易被破坏，且酶的高级结构变化少，因而酶活力损失很少。但是物理吸附法固定的酶与载体相互作用力弱、酶容易从载体上脱落下来。与物理吸附法相似，离子结合法的优点是：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺点是：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。但是与物理吸附剂相比，离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，约50～150 mg蛋白每克载体。 3共价结合法 ○
共价结合法是指借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固定化方法。
（2）无固体载体交联法
交联法是指利用双功能或多功能试剂（bifunctionalor multi－functional reagent）在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。它与共价结合法的不同之处是它不使用载体。
交联法的优点是操作简便。其缺陷则是交联反应的过程往往比较激烈，因为交联反应可能发生在酶分子间，也可能发生于分子内，分子间交联和分子内交联的比例在一定程度上和酶的浓度与交联试剂的浓度有关，也与pH、离子强度有关，如果交联条件控制不合适，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。 （3）包埋法
包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。
包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶．对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。
1凝胶包埋 ○
凝胶包埋法是将酶分子包埋在多孔凝胶中。 2微囊化 ○
微囊型包埋是指将一定量的酶溶液包在半透性的高分子微孔膜内。
与凝胶包埋法相比，微囊法包埋的优点是：固定化酶颗粒比前者要小得多，比较有利于底物和产物扩散，能容许小分子底物和产物自由出入膜内外，由于囊的表面积与相对体积的比值大，故物质交换可以进行得十分迅速。另一方面半透膜还能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注人体内时既可避免引起免疫过敏反应，同时也可免遭蛋白水解酶的降解，因此其具有较大的医学价值。缺点是反应条件要求高，制备成本也较高。
（4）不同固定化方法的联用
不同的固定化方法有各自的优缺点，在实际的固定化操作中，经常把各种固定化方法联用，以获得最佳效果。通常的联用有吸附加交联和包埋加交联。
3.如何评价固定化酶的固定化效果。
由于选用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性质也有所不同，因此需要对不同的固定化方法进行评价。评价的指标主要有： （1）固定化酶的比活
每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 （2）操作半衰期
是衡量稳定性的指标。指在连续使用的条件下，固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）。固定化酶的操作半衰期是影响其实际应用的重要因素。
(3)偶联效率＝（加入的蛋白量－溶液中残留的蛋白量）/加入的总蛋白量×100％ (4)活力回收＝(固定化酶活力/投入的总酶活力)×100％
(5)相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。 (6)酶载量 单位载体所固定的酶活力（或酶蛋白量）。
4.简述固定化对酶性质的影响（固定化酶的性质）。
（1）稳定性 大多数酶固定化后，稳定性都增强，操作寿命和保存寿命也 延长。
（2）固定化酶的最适温度和最适pH 固定化后，大多数酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力－pH曲线常常会发生偏移。带负电荷的载体固定化的酶的最适pH向碱性偏移，带正电荷的载体固定化的酶的最适pH向酸性偏移。 （3）固定化酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。
（4）固定化酶的专一性 酶固定化后，一般不会改变其专一性。但也有少数情况酶固定化后专一性会发生改变。
5.简述固定化细胞作为生物催化剂的优点和缺点。 固定化细胞的优势和局限性（第1题第（3）项）
6.设计实验固定化酿酒酵母进行乙醇生产。
7.设计实验测定固定化葡萄糖异构酶的活力和比活力的方法。
8.涉及啤酒生产中常用的木瓜蛋白酶的固定化方法。
9.查阅资料分析某种交联酶晶体的制备过程以及应用。
10.比较有载体固定化和无载体固定化生物催化剂各自的优势。
第五章 化学酶工程
1.简述酶分子化学修饰的基本原理
酶的化学修饰主要是对一些活泼性比较强的氨基酸侧链基团进行修饰。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团在酶蛋白分子中可以形成各种次级键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。这些侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象及微环境的改变，从而改变酶的特性和功能。对这些基团进行修饰后，对酶的性质影响大，修饰效果明显。
2.酶分子被化学修饰后在性质上有哪些变化？
首先要强调的是，我们对酶进行修饰的目的就是要改变酶的结构和特性，而且要使这种改变朝着对人类有用的方向进行。不管是从理论上分析还是从实际修饰的结果来看，酶经修饰之后，性质朝任何方向改变的可能性都存在，而且多数改变都是不利的。酶修饰之后，性质的变化因酶、修饰剂和修饰方法的不同而出现很大的差异。 （1）热稳定性
用前面介绍的一些修饰剂对酶进行修饰，在多数情况下可以提高酶的稳定性。但PEG没有明显的提高。 （2）抗原性
抗原性是药物用酶必须解决的问题。在前面介绍过的修饰剂中，被认为可以消除酶的抗原性的修饰剂只有PEG和人血清白蛋白。 （3）对各类失活因子的抵抗力
由于酶修饰之后，表面会带上修饰剂而受到保护，因此，酶修饰之后，抵抗蛋白酶水解和其它失活因子的能力普遍增强。 （4）在生物体内的半衰期
由于修饰之后，稳定性和对抗各种失活因子的能力增强，因此，半衰期也普遍延长。
3.酶分子的哪些侧链可以被修饰？
①羧基可用碳二亚胺、硼氟化三甲烊盐和甲醇修饰
②氨基可用酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸等修饰 ③巯基包括形成二硫键、有机汞、取代、氧化等几种方式。 ④咪唑基 ⑤（酚）羟基 ⑥胍基
⑦色氨酸吲哚基
4.为什么环糊精及其衍生物可以作为模拟酶模型，该模型与大型环冠醚模拟酶模型有何区别？
5.简述抗体酶催化的反应类型有哪些？ ①氨基转移酶
生物体内蛋白质的合成是一个非常复杂过程。氨基酸在掺入肽链之前必需进行活化以获得额外能量，这活化过程即酰基转移反应，又称氨酰基化反应。
②重排反应
Claisen重排是有机化合物异构化的一种重要形式，生物体由一些化合物在光照下会发生Claisen重排。 ③氧化还原反应
氧化还原反应在生物体内十分广泛，主要是呼吸链的一系列反应。 ④金属螯合反应
金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合来说意义重大。 ⑤磷酸酯水解反应
磷酸二酯键是自然界最稳定的键之一，因此，它的水解对抗体酶来说是个挑战。 ⑤其它反应
抗体酶还可催化磺酸酯水解反应和光诱导反应等反应类型，随着抗体酶的研究与开发的深入，抗体酶催化的反应类型也将越来越多，并为人们所用。
6.抗体酶有何特性？
①能催化一些天然酶不能催化的反应
抗体酶的多样性决定了抗体酶的催化反应类型多样性；催化抗体的构建，表明可通过免疫学技术，为人工酶的设计和制备开辟一条新的、实用化的途径。这种利用抗原-抗体识别功能，把催化活性引入免疫球蛋白结合位点的技术，或许可能发展成为构建某种具有定向特异性和催化活性的生物催化剂的一般方法。 ②有更强的专一性和稳定性
抗体酶作为一种具酶和抗体双重功能的新型大分子用作分子识别元件，具有优于酶和抗体的突出特点。因为配体底物与抗体酶的活性部位结合后，会立即发生催化反应，释放产物，所以每一次分子反应之后，抗体的分子识别位点都可以再生，这就使催化抗体能够作为一种可以连续反复使用的可逆性分子。 ③催化作用机制不同
酶催化机制是“锁钥学说”（Lock and Key）及“诱导契合学说”（Induced-Fit）；而抗体酶的催化剂至目前还没有完全搞清楚。Janda曾提出“识别开关”或“诱饵开关”（Bait and Switch）机制，即抗体将底物“钓进”抗体结合部位，然后使其与抗体结合，打开底物转化为反应过渡态的“开关”，导致共价键断裂，形成产物，还有待研究。
7.简述分子印迹的基本过程
所谓分子印迹（molecular imprinting）是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫印迹分子（print molecular，P）或叫模板分子（template，T）。印迹技术包括下列内容：
①选定印迹分子和功能单体，使两者发生互补反应。
②与印迹分子发生互补作用的单体与其它单体共同发生聚合反应。
③将印迹分子从聚合物中去除。这样形成的聚合物内就保留有和印迹分子的形状、大小完全一样的空穴，印迹的聚合物能维持相对于印迹分子的互补性，因此，该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。
第六章 生物酶工程
1.什么是酶基因的克隆，其基本步骤有哪些？
