在2mL/min左右。
(6)胶板灌满后，顶部插入梳子，凝固2小时。 三、DGGE凝胶电泳步骤及染色
(l)在DGGE槽中加7L左右1*TAE(DGGE专用)，使槽中的水至Full和Run的中间位置；加盖，注意长杆进入底部的窟窿中，打开电源，将温度设置到60℃，打开heat键。
(2)当梳子位置的胶凝固好后，将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上，如果只有1板胶，注意另一侧也要固定玻璃板(不加spacer)，否则漏水。安装好玻璃板后，将凝胶板架(红点在右边)放入水槽中，之后将温度控制器盖在电泳槽上，注意长杆进入底部的窟窿中。打开电源，打开heat键和bump键，开bump键后，水位会下降，降至run与maxmum的中间，水若不够的话，关闭电源，打开温度控制器上方的探望口，加1*TAE补足。
(3)温度达到60℃，立即进样，先关掉所有电源，取下温度控制器，小心地拔掉梳子，用移液枪冲洗侮一个进样孔；进样要缓慢，使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。每一个进样孔加入25μL样品。
(4)将温度控制器盖在电泳槽上，打开电源，将温度调到60℃，打开heat键和bump键，运行5min后，在主机上插入红黑电源线，注意红黑线不要颠倒。打开主机电源，将电压调到120V，时间调为5h。
(5)电泳结束后，关掉电源，打开盖子，将凝胶板架拿出，控水，卸下玻璃板。将clamp卸下，手抓住spacer，向内侧拧，揭下短玻璃板，胶粘在长玻璃板上。 (6)将托盘上平铺张保鲜膜后，将长板和胶放入托盘中银染。
银染步骤
步骤：
固定 敏化 洗涤 银染 洗涤 显影
时间
30 min 2*10 min
冲洗30 s，漂洗5*5 min 30 min
溶液
10%冰醋酸、30%乙醇，100 ml 30%乙醇，100 ml 双蒸水
新鲜配制的0.1%AgNO3，100 ml，使用前加入370 μl的福尔马林溶液
冲洗30 s，漂洗1 min，再冲洗30 s 双蒸水 直至显示条带为止，密切观察
溶液1：0.2 g硫代硫酸钠于10 ml水中 溶液2：2.5 g碳酸钠于100 ml水中 将100 μl溶液1加入溶液2中，再加350 μl的福尔马林溶液
终止 30 min
5.84 g EDTA2Na·2H2O以及8 g Glycine于双蒸水中，定容至400 ml（也可用10%的冰醋酸）
保存 长时间保存
长达数日 干胶
10%甘油 自然干燥即可
（1） AgNO3母液（20%）：将2 g AgNO3溶解于双蒸水中，定容至10 ml，放置于棕色瓶中
密闭保存。每次使用时取2 ml母液，稀释至400 ml，再加入福尔马林。 （2） 10*Tris EDTA（TE）：pH=8.0 A．100mmol/L Tris-CI（pH=8.0） B．10mmol/L EDTA (pH=8.0)
C．Tris-Cl(1 mol/L)：用800 ml蒸馏水溶解121.1 gTris碱，加浓盐酸调pH值至所需值。
银染原理：银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。
如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。基于硝酸银的应用要多于后者（据说Silver diammine比较费“银子”），现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。
银离子容易被还原，在PAGE胶上，哪里的银离子先开始被还原，哪里就先开始出现条带。通常由于蛋白质结构上的复杂性，一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合，所以有蛋白的地方银离子较少，如果不做任何处理，有蛋白的部位将会染色更浅，所以最初的银染是负染。那最初的负染是如何演变成正染色的呢？一方面是选用还原速度较慢的还原剂，如甲醛，另一方面，利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去，由于银离子对蛋白质有一定的结合力，故更多地保留在有蛋白的位置，于是形成了正染。但是这种染色的方法灵敏度还不是很高，所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤，能够使银染敏化的试剂很多，一类是增加蛋白质与银离子的结合位点，如SDS等；还有一类能使银离子和蛋白形成silver sulfide等结合，硫代硫酸盐起到的就是这个作用；还有的试剂兼顾上述两种功能，如戊二醛。通过敏化过程，银染的灵敏度大大增加，同时也降低了背景。综上，银染的原理概括如下：让银离子尽可能多的于蛋白结合，尽可能的洗掉胶上的银离子，然后还原显色。
各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。最为经典的一个版本是这样的：谈谈其中一些具体步骤：
1.固定，固定的作用主要是使蛋白变性，防止蛋白在扩散
2.敏化，戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合，但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉，原因是对蛋白造成修饰（在我的实验中，有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白，不知道是不是去掉更好）。乙酸钠的作用应该是缓冲pH。
3.染色，有的protocol中这一步不加甲醛，不加甲醛使后面的显色速度将大大降低。 4.显色，碳酸钠的作用是提供碱性环境，在碱性环境下甲醛才能发挥它的慢还原特性。这一步中的硫代硫酸钠有增加银化合物溶解的能力，防止氯化银在胶表面形成薄膜，但是在质谱兼容银染中，硫代硫酸钠也是省去的。 5.终止，顾名思义，显色成功后终止反应。
评价好的银染方法主要基于以下几个方面：灵敏度，重复性，速度。个人认为平衡好灵
敏度和重复性是实验的关键，速度可以放在后面考虑。如果不知道哪个版本的银染更为合适，那么上面的那个经典版本是个不错的选择，之后可以根据具体的结果，并参考银染的原理做些优化。
通常银染方法简单，只需几步。电泳后，在醋酸中固定胶除去电泳液和凝胶中的尿素，并防制小的延伸产物的扩散。换几次蒸馏水除去固定剂。胶在硝酸银和甲醛中染色。在染色后，将凝胶用水清洗，在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中显色。甲醛将银离子还原为金属银。硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。在显色一定的时间后，用水清洗一下，在空气中干燥。
(7)用Bio-Rad Gel DocTMXR凝胶成像系统观察并拍照。
（四）DGGE图谱目的条带的克隆测序
1.DGGE图谱目的条带DNA的提取与PCR扩增
将切取下来的目的条带浸泡在TE溶液中，4 ℃过夜，得到的溶液即可作为PCR反应的模板。PCR
反应体系与程序与之前相同，采用引物对
BSF338
(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和BSR534(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)。PCR反应体系（25 μl）: 10×Ex Taq buffer(Mg2+)2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，20 pmol/L正反引物各0.75 μl，模板DNA10～100 ng，Ex Taq 0.25 μl，加双蒸水补足至25 μl。PCR反应程序：94℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃最终延伸10 min。扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 2.PCR产物的胶回收
采用E.Z.N.A Gel Extraction Kit，操作步骤如下：
(1) 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的凝胶。 (2) 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5 ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为1 g/ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2 g 则其体积为0.2 ml；加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55 ℃~65 ℃水浴中温浴7 min至凝胶完全融化，其间每隔2-3 min混匀一次；
(3) 转移700 μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2 ml收集管内，室温下，10000 ×g离心1 min，弃去液体；
(4) 将柱子重新套回收集管中，加300 μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中，室温下，10000 ×g离心1分钟，去弃滤出液；
(5) 将柱子重新套回收集管中，加入700 μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10000 ×g离心1 min，去弃滤出液；
(6) 将柱子重新套回收集管中，重复加入700 μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10000 ×g离心1 min，弃去滤出液；将空柱子重新套回收集管中，10000 ×g离心1 min以甩干柱基质残余的液体；
(7) 把柱子装在一个干净的1.5 ml离心管上，加入30~50 μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10000 ×g离心1 min，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20 ℃。 3.目的DNA与pMD19-T载体的链接转化
反应体系（10 μl）如下：pMD19-T 1μl，模板DNA 4 μl，SolutionⅠ 5 μl，16 ℃连接过夜。
连接产物的转化：
(1)把感受态细胞置于冰中融化；
(2)把100 μl的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内； (3)加入用于转化的DNA； (4)冰中放置30 min； (5) 42 ℃放置45～60 s； (6) 冰中放置2～3 min；
