（2）试管菌种接到平板培养基的方法
①左手持平板和试管菌种，右手松动试管试管棉塞，烧接种工具。 ②右手小指与四指取下棉塞，取菌，打开平皿。 ③将菌种接种到平皿上，立即盖上平皿。 ④酒精灯火焰上烧接种工具灭菌 ⑤棉塞过火，重新塞上试管。 3. 培养
1）将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后观察。 2）将接种分离后的酵母菌和霉菌放在25～28℃的恒温箱内，酵母菌培养48h，霉菌培养72h后观察。
3）平板培养基置于恒温箱内倒置培养。
问题与思考
1．为什么从事微生物实验工作的最基本要求是无菌操作？
2．大肠杆菌接种于葡萄糖肉汤培养基内培养24小时后，会出现什么情况？
实验五、细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的
了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
Ⅰ、细菌简单染色法
一、实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐(methylene blue chloride，缩写为M B C)；它可被电离成正、负离子：
M B C?methylene blue?? chloride-
带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)、碱性复红(basic fuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
二、实验器材
1、 菌种 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus
cereus)；
2、 仪器 显微镜；
3、 材料 接种环，酒精灯，火柴，载玻片，洗瓶，废液缸，擦镜纸，吸水
纸；
4、 染料 草酸铵结晶紫或石碳酸复红。
三、操作步骤
1、涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2、干燥 将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。
3、固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料； 4、染色 玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染l-2min。
5、水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6、干燥 自然干燥或用吸水纸 盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。
7、镜检 用油镜观察并绘出细菌形态图。
8、清理 实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。
四、注意事项
1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。
Ⅱ、革兰氏染色法
一、实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G?菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G?菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
二、实验器材
1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜
面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；
2、仪器 显微镜；
3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红
染色液；
三、操作步骤
1、 涂片 在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大
肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。
2、 固定 将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过
热，以载玻片不烫手为宜。
3、 染色
⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜
为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
⑶脱色 滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。 ⑷复染 滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。
4、 镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G?)；
被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。
四、注意事项
1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。
2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
问题与思考
（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
实验六、藻类的培养、观察、计数 一、实验目的：
1、通过实验了解藻类生长的基本条件和方法，掌握淡水微藻的基本培养方法； 2、显微镜下观察并识别几种常见淡水微藻；
3、了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 二、实验材料：斜生栅藻、小球藻、铜绿微囊藻； 三、主要实验仪器和器皿
１．显微镜，血球计数板，计数器 ２．培养瓶（三角瓶） ，量筒； 四、试剂
１．培养液： BG11 培养液 ２．碘固定液 五、培养条件：
光照强度：1200Lux、温度：20-25℃、光照时间：24h连续光照 六、方法和步骤
1、前期准备：各种器皿的消毒、培养液的配制、准备并培养 3 种不 同的淡水微藻：斜生栅藻、小球藻、铜绿微囊藻；
2、接种：将不同的实验藻种分别接种到盛有培养液的不同三角瓶 (100ml)中,接种的藻容量和新培养液之间的比例为 1：2～1：3。培养量与总容量的比小于 2/3；
3、培养 ：按上述培养条件进行培养，在培养的过程中，每天摇瓶 3 次，使藻类充分见接触氧气和光照；
4、换代：5-7 天换代 1 次，换代浓度同上；
5、固定：将藻液摇匀，用小三角瓶分别倒取一定量(20-30ml)的上述3种藻液加入几滴碘液，摇匀杀死细胞；
6、取样：摇匀后，用吸管吸取上述不同的藻液分别滴到盖有盖玻片的血球计数板的边缘，使藻液慢慢进入盖有盖玻片的区域，避免盖玻片浮起，用吸水纸轻轻吸走多余的藻液，每种藻液取样 2 次；
