图1 灭菌的试管培养基趁热摆成斜面
6. 加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7. 包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。
8. 保存 灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。 问题与思考：
1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？ 2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？ 3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？
实验三 消毒和灭菌
一、实验目的
了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、实验原理
灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养 不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。
灭菌的方法，通常可以分为四大类：（1）加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。
在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
一般培养基用0.1MPa、121.1℃.
15～30min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变. 三、材料与仪器
吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。 四、实验步骤
（一）干热灭菌法 适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。
1．将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。
2．接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。
3．当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。 4．切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。 （二）高压蒸汽灭菌
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
3．用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
4．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。
5．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。
问题与思考
1．干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？ 2．为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？ 3．高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？
实验四、微生物接种技术 一、实验目的
1. 掌握微生物各种接种方法。 2. 掌握无菌操作的基本环节。 二、实验原理
在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。在接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌
侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。 三、材料与仪器
（一）菌种
大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌
（二）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤半固体培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。
（三）接种环、接种针、接种钩。镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。 四、实验步骤
1．接种前的准备工作 （1）检查接种工具。
（2）在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接咱的菌名、操作者、接种日期等。
（3）将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。
2．接种方法 （1）试管接种方法
①将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟出。
②置试管口于酒精火焰附近；
③将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。
④用接种工具取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
⑤取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。 ⑥重新塞上棉塞。
⑦烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种工具放回原处。
