解答：用带标记的脱氧核苷三磷酸作为合成DNA的原料，经过一段时间后，加入碱溶液使合成停止，检查发现标记出现在大约1000个核苷酸的小片段DNA即冈崎片段上，追赶标记发现，这些带标记的小片段DNA很快能够连接成DNA长链，后来的研究发现，DNA复制时，前导链是连续合成的，后随链需要先合成冈崎片段。
6．某哺乳动物的细胞中，每个细胞的DNA长1.2m，细胞生长周期中的S期约为5h，如果这种细胞DNA延长的速度与E.coli相同，即16μm/min，那么染色体复制时需要有多少复制叉同时运转？
解答：每个复制叉5h复制DNA片段的长度为16μm/min × 300min = 4800μm。每个细胞内DNA长1.2m = 1.2 × 106μm，染色体复制时应当有1.2 × 106μm ÷ 4800μm = 250个复制叉。
7．DNA复制的精确性、持续性和协同性是通过怎样的机制实现的？
解答：DNA聚合酶Ⅲ具有复杂的亚基结构。其3′→5′外切酶活性起到校对作用，不对称二聚体相互协调，两个β亚基形成滑动夹子，维持了DNA合成的持续性。复制叉有多种蛋白质协同作用，使DNA复制的各个环节能够协调进行。
8．真核生物DNA聚合酶有哪几种？它们的主要功能是什么？
解答：真核生物的DNA聚合酶主要有α、β、γ、δ、ε五种，均具有5′→ 3′聚合酶活性，DNA聚合酶γ、δ和ε有3′→5′外切酶活性，DNA聚合酶α和β无外切酶活性。因此设想细胞核DNA复制时，在复制叉上由DNA聚合酶α/引物酶合成RNA引物和一小段DNA，DNA聚合酶δ或DNA聚合酶ε合成前导链和滞后链。不过目前尚不清楚两种酶哪个合成前导链，哪个合成后随链。DNA聚合酶β和ε主要起修复作用，DNA聚合酶γ用于线粒体DNA的合成。近年又发现了多种参与修复的DNA聚合酶。
9．DNA的复制过程可分为哪几个阶段？其主要特点是什么？
解答：DNA的复制过程分为三个阶段，各阶段的特点主要表现在复制体的变化。起始阶段，形成起始复合物；延伸阶段，DNA聚合酶Ⅲ进行持续的DNA复制；终止阶段，复制体解聚，形成两个新的子代分子。
10．哪些因素能引起DNA损伤？生物体有哪些修复机制？
解答： 引起DNA损伤的途径有：生物因素如复制差错或病毒整合，物理因素如紫外线和电离辐射，化学因素如各种化学诱变剂。目前已知细胞有5种对DNA损伤的修复系统：错配修复、直接修复、切除修复、重组修复、易错修复（SOS修复）。
11．在大肠杆菌DNA分子进行同源重组的时候，形成的异源双螺旋允许含有某些错配的碱基对。为什么这些错配的碱基对不会被细胞内的错配修复系统排除？
解答：大肠杆菌在进行错配修复的时候，根据老链和新链的甲基化程度不同而识别出新链上错配的碱基，再将新链上错误的碱基切除，而不会切掉旧链上正确的碱基。在DNA进行同源重组的时候，形成的异源双螺旋尽管会含有某些错配的碱基对，但异源双螺旋的两条DNA链上都是高度甲基化的，因此这些错配的碱基对不会被细胞内的错配修复系统排除。
12．试比较切除修复和光复活机制是如何清除由紫外线诱导形成的嘧啶二聚体的？你可使用什么方法区分这两种机制？
解答：切除修复需要将嘧啶二聚体切除掉，换上正常的胸苷酸，而光复活机制是通过光复活酶直接破坏嘧啶二聚体的环丁烷结构而修复嘧啶二聚体。可使用[3H]标记的胸苷追踪修复过程，如果[3H]出现在修复后的DNA分子上，则修复的方式是切除修复，否则就是光复活机制。
13．经证实2′, 3′―双脱氧次黄嘌呤可作为抗HIV药，试解释它抑制AID病毒生长的机理。
解答：因为双脱氧次黄嘌呤可以转换为相应的双脱氧次黄嘌呤核苷三磷酸，在DNA复制时，它可以作为dGTP的类似物，将双脱氧次黄嘌呤核苷酸掺入到新合成的DNA链中，但由于它没有3?-OH，所以可以阻断核苷酸链的进一步延伸，因此HIV基因组的复制被抑制。
14．概述PCR的基本过程。
解答：聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的基本过程是在试管内加入含有待扩增DNA片段的双链DNA，分别能与待扩增DNA片段两侧的特定序列互补的两个寡核苷酸引物，4种dNTP，含有一定浓度Mg2+的缓冲液，和耐热的DNA聚合酶，通过加热到95℃左右使DNA变性，降温到55℃左右使引物与模板结合，升温到72℃左右合成新链3个步骤的循环，可以使DNA扩增。若扩增效率为100%，每循环1次，DNA可增加1倍，若循环30次，则DNA增加230倍，若扩增效率为x（用小数表示，如80%表示为0.8），扩增的次数为n，得到产物的量为目的基因加入量的y倍，则可用下列公式计算扩增产物的量：
y = ( 1 + x )n
15．概述基因克隆的基本步骤。
解答：基因克隆的基本步骤有：① 用相互配套的1～2种限制酶切割含目的基因的DNA和载体DNA（切）；② 连接目的基因和载体DNA得到重组载体（接）；③ 将重组载体导入宿主细胞（转），若使用的是质粒载体，称转化，噬菌体载体称转导，病毒载体称转染；④ 将经过转化（或转导，转染）的细菌或细胞稀释，在加有选择性培养基的平皿培养基或细胞培养板上培养，选择含目的基因的阳性克隆，并用其它方法进一步鉴定（筛）；⑤ 扩大培养选出的阳性克隆（扩）。随后可分离目的基因，或在一定的条件下表达目的基因。
14 RNA的生物合成
1．原核生物的RNA聚合酶由哪些亚基组成？各个亚基的主要功能是什么？
解答：原核生物的转录作用，不论其产物是mRNA，rRNA，还是tRNA，都是由同一种RNA聚合酶催化合成的。用SDS-PAGE分离大肠杆菌RNA聚合酶可得几个大小不等的亚基：β、β?亚基的Mr分别为1.5×105和1.6×105，α和ζ的Mr分别为4.0×104和7.0×104。用磷酸纤维素柱层析分离出由各个亚基组成的全酶（holoenzyme），其亚基组成为α2ββ?ζ，Mr约为4.65×105。其中的ζ因子易于从全酶上解离，其他的亚基则比较牢固地结合成为核
心酶（core enzyme），当ζ因子与核心酶结合成全酶时，即能起始转录，当ζ因子从转录起始复合物中释放后，核心酶沿DNA模板移动并延伸RNA链。可见ζ因子为转录起始所必需，但对转录延伸并不需要。全酶以4种核苷三磷酸为原料，以DNA为模板，在37℃下，以40nt/s的速度从5?→3?合成RNA。一个大肠杆菌约含7000个RNA聚合酶分子，大约2 000～5 000个聚合酶同时催化RNA的合成。
α亚基由rpo A基因编码，为核心酶的组装所必需，需责识别和结合启动子。α亚基在全酶与某些转录因子相互作用时也发挥重要作用。
β和β?亚基分别由基因rpo B和rpo C编码。β亚基是催化部位的主体，研究表明，β亚基有两个结构域，分别负责转录的起始和延伸，β?亚基上结合的两个Zn2+参与催化过程。β?亚基可能是RNA聚合酶与模板DNA的结合部位。
大肠杆菌的ζ因子由基因rpo D编码，在对启动子识别中起关键作用。ζ因子与核心酶结合后，全酶对启动子特异性结合能力是对其他DNA序列结合能力的107倍。
2．真核细胞中有几种RNA聚合酶？它们各自的主要功能是什么？
解答：真核生物的RNA聚合酶，按照对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同进行分类：RNA聚合酶Ⅰ基本不受α-鹅膏蕈碱的抑制，在大于10-3mol/L时才有轻微的抑制。RNA聚合酶Ⅱ对α-鹅膏蕈碱最为敏感，在10-8mol/L以下就会被抑制。RNA聚合酶Ⅲ对α-鹅膏蕈碱的敏感性介于聚合酶Ⅰ和聚合酶Ⅱ之间，在10-5mol/L到10-4mol/L才会有抑制现象。RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中，其功能是合成5.8S rRNA、18 S rRNA和28 S rRNA。RNA聚合酶Ⅱ存在于核质中，其功能是合成mRNA、snRNA。RNA聚合酶Ⅲ也存在于核质中，其功能是合成tRNA和5 S rRNA及转录Alu序列。
3．下面是单链DNA模板的碱基序列，将它与RNA聚合酶、GTP、CTP、UTP和[α-32P]ATP混合物一起保温，再用脾磷酸二酯酶水解RNA产物，试问可得到哪些3′-32P标记的NMP？
5′ATCTTCGTATGCATGTCT 3′
解答：根据DNA模板的碱基序列先写出RNA产物的碱基序列，每个A的5?端为32p：
5′32pApG32pApC32pApUpGpC32pApU32pApCpG32pA32pApG32pAp U 3′
脾磷酸二酯酶从RNA的5?–末端开始依次水解生成3?–NMP，得到3?–32p[GMP]∶3?–
32
p[CMP]∶3?– 32p[UMP]∶3?–32p[AMP]=3∶2∶1∶1。
4．原核生物的启动子和真核生物的三类启动子各有何结构特点？
解答：原核生物的启动子在-10区有一共有序列（consensus sequence）TATAAT，以发
现者的名字命名为Pribnow框(Pribnow box)，或被称作-10序列。在-35区还有一个共有序列TTGACA，被称作识别区域，或-35序列。在不同基因的启动子中，这两个共有序列的位置和序列略有区别。对上述共有序列进行化学修饰和定位诱变证明，-35序列与聚合酶对
启动子的特异性识别有关，-10区富含A-T对，有利于DNA局部解链，-10区与-35区之间的距离，明显影响转录的效率。
真核生物三类启动子分别起始RNA聚合酶I、II、III的转录。类别I启动子包括核心启动子和上游控制元件两部分，需要UBF1和SL1因子参与作用。类别II启动子包括四类控制元件：基本启动子、起始子、上游元件和应答元件。识别这些元件的反式作用因子有通用转录因子、上游转录因子和可诱导的因子。类别III启动子有两类：上游启动子和基因内启动子，分别由装配因子和起始因子促进转录起始复合物的形成和转录。
5．简要说明原核生物和真核生物转录调控的主要特点
解答：原核生物与真核生物基因转录调控的共同之处主要有两个方面。其一，调控的关键步骤均在转录的起始阶段。其二，DNA上均包括参与转录调控的顺式作用元件，细胞中均含有可以同顺式作用元件相互作用的反式作用因子。
原核生物基因转录调控的特点可归纳为3个方面：①?σ因子决定RNA聚合酶的识别特异性。原核生物只有一种RNA聚合酶，核心酶催化转录的延长，σ因子识别特异的启动序列，即不同的σ因子协助启动不同基因的转录。②?操纵子模型的普遍性。除个别基因外，原核生物的绝大多数基因按功能相关性成簇地连续排列在DNA分子上，共同组成一个转录单位即操纵子（operon），如乳糖操纵子等。一个操纵子含一个启动序列及数个编码基因。在同一个启动序列控制下，转录出多顺反子mRNA。③?阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性。在原核生物中特异的阻遏蛋白是控制启动序列活性的重要因素。当阻遏蛋白与操纵基因结合或解离时，结构基因的转录被阻遏或去阻遏。
真核生物基因转录调控的特点可归纳为6个方面：①?真核生物有复杂的染色体结构，染色体结构的变化对基因转录的调控有重要作用。②?与原核生物相比，真核生物有更多种类的顺式作用元件和反式作用因子，基因转录调控的机制更加复杂。③?原核生物的反式作用因子对基因表达的调控既有正调控，又有负调控，其中负调控的作用较普遍。真核生物的反式作用因子对基因表达的调控主要是正调控，通常需要多个反式作用因子协同作用，使基因表达的调控更加精确。④?迄今为止，在真核生物中尚未发现操纵子结构，功能相关基因的协调表达比原核生物更加复杂。⑤?原核生物的转录产物通常不需要加工，即可用于指导蛋白质合成，真核生物的转录产物通常需要经过复杂的加工，才可用于指导蛋白质合成。⑥?真核生物大多为多细胞生物，在细胞分化和个体发育过程中，基因表达除受细胞内调控因子的影响外，还受一些细胞外因子（如激素和细胞因子）的影响。
6．简要说明四类内含子剪接作用的特点。
解答：第一类内含子的剪接反应需要一个鸟嘌呤核苷或核苷酸辅因子，这一辅因子并不是被作为能源使用，而是直接参与反应的催化。剪接反应是第一步中鸟苷的3?-羟基作为亲核基团，与内含子5?-末端形成一个正常的3?,5? -磷酸二酯键。这一步中5?外显子的3?-羟基被释放出来，然后作为亲核基团在内含子的3?末端进行同样的反应。导致内含子的切除，及
