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黄曲霉毒素的检测技术
作者：刘艳丽 陈建华 王芳 李伟 来源：《新农村》2010年第09期
摘 要:目前黄曲霉毒素(AF)的测定方法很多,主要有薄层层析法(TLC), 酶联免疫吸附法(ELISA),高效液相色谱法(HPLC)等。本文结合国内、外有关文献,对黄曲霉毒素的检测技术的研究进展进行了综述,并且在此基础上探讨了未来对饲料安全研究的方向,旨在使人们更好的保障饲料安全,预防黄曲霉毒素中毒。
关键词:黄曲霉毒素 检测技术 酶联免疫吸附法
黄曲霉毒素(Aflatoxins,简称AF)发现于20世纪 60 年代,它是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉产生的一组次生代谢产物,目前已知的黄曲霉毒素及其衍生物有20余种即B1、B2、B2a、G1、G2、G2a、M1、M2等。黄曲霉毒素B1是其中毒性最大的一种,有实验结果显示,其剧烈的毒性比人们熟知的剧毒药氰化钾强10 倍。它可诱发癌症和皮下肉瘤,并且可使动物的肝、肾、大脑和神经系统等产生病变。黄曲霉毒素对人、家禽、家畜的健康威胁极大[1-6], 欧盟等国家和地区普遍要求其限量为:B1+B2+G1+G2≤4μg kg,B1≤2μgkg。对此,检测方法必须具备较高的灵敏度和可靠性,以保证饲料及食品的安全。 一、薄层层析法(TLC)
测定AFT的经典方法是薄层层析法(TLC),一般先经层析后,在测定其吸收值或荧光值[7],但该方法操作比较繁琐且检出低限不能满足某些国家的卫生限量要求。王宏亮(1998)对GB5009.22—85所规定的方法进行了部分的改进,主要是在提取与净化过程中,在用氯仿抽提前,加入25%的醋酸铅溶液5ml和4%的NaCl溶液5ml,再用氯仿振动抽提。于薄层板点样后展开时先用氯仿与丙酮(90:10)的混合液正向展开,然后用无水乙醚进行反向展开。改进后的方法,黄曲霉毒素B1形成的斑点易观察,操作简便。在薄层层析法的基础上薄层荧光色谱扫描法,使检测更快捷、更准确。卢大用,利用碱能使黄曲霉素分解的原理,无需进行层析分离而测其荧光值,建立了测定微生物中黄曲霉素含量的一种新的快速荧光法。 二、 酶联免疫吸附法(ELISA)
酶联免疫吸附法(ELISA)利用抗原抗体反应原理测定AFT,具有技术先进、灵敏度高、特异性强、精确度高、测定速度快、成本低、污染少、一次可测定大批样品、能限量和定量测定等优点,已被列入测定食品、饲料中AFB1的国标方法。已证明,采用ELISA法测定黄曲霉毒素B1的试剂盒应用,线性重现性较好,但试剂盒价格较贵,且有效期较短,使该方法的应用推广存在局限性。李汶(2000),采用ELISA用自配试剂及试剂盒, 测定常用中药黄曲霉毒素B1取得了良好效果。
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三、高效液相色谱法(HPLC)
免疫亲和柱技术高效液相色谱法,利用免疫亲和反应原理,采用大剂量的单克隆抗体,选择性的吸附提取液中的抗原物质-黄曲霉毒素。在我国,已有人成功的用高效液相色谱法测定花生中的黄曲霉毒素。黄曲霉毒素在牛奶及奶制品中,通常以M1的形式存在,AFTM1是AFTB1在生物体内的羟化产物,世界卫生组织(WHO)将AFTM1列为ⅡB类可疑致癌物。由于儿童和老人是牛奶消费的重要人群,因此加强对AFTM1的检测,对于保护人类健康具有重要意义。张鹏[19](2001)提出了以免疫亲和柱(immunoafiinity,IAC)净化结合反相高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素的新方法。 四、黄曲霉基因的研究
Yu(1995)研究证明,黄曲霉毒素(AF)合成至少要在16种酶作用下完成,在60kbDNA片段内,合成AF有9个基因,其中pksA,uvm8,aad基因,分别是多聚乙酰合成酶芳香合乙醇脱氢酶、脂肪酸合成酶基因的同系序列,ard-1和ard-2基因的cDNA序列可能涉及后阶段AF合成。ard-1基因产物与细胞色素P-450型酶是同系。目前,国内外多从基因技术方面寻求解决黄曲霉毒素污染的新方法。Kenneth (2004)指出可以利用AF36基因的抑制黄曲霉毒素的产生,并且已成功的分离了AF36。GT-MAS:gk and MI82,两种能抵抗黄曲霉菌传染和黄曲霉毒素污染的玉米基因型。 五、小结与展望
虽然目前检测黄曲霉素的方法很多,但多有一定的不足,国标采用的薄层色谱法(TCL)灵敏度差,且样品前处理繁琐、耗时长及净化不理想;而酶联吸附免疫法(ELISA)重复性差、且试剂寿命短;高效液相色谱法(HPLC)成本过高,随着检测技术的发展,对黄曲霉毒素的检测也会进入一个新的时期。 参考文献:
[1] 姜开煌 , 崔贵玉 等.鸡黄曲霉毒素中毒的诊疗.黑龙江畜牧兽医1995.11期. P42 [2] 高纯一,丁营兵 .梅花鹿黄曲霉毒素中毒的治疗 .中国兽医科技.1994 .11期. P30 [3] 周长锋,猪黄曲霉毒素中毒的诊断与防治.中国兽医杂志. 1994.7期. P21-22 [4] 张 军 ,黄光琪 等.鸭 黄 曲 霉 毒 素 中 毒 一 例. 河南畜牧兽医.2004. 6期.P46 [5] 周艺林,饲料中黄曲霉毒素对畜禽的危害及控制方法.贵州畜牧兽医.2004 .2期. P 8-9 [6]刘庆才,耿元福,张俊宝 等 . 黄牛黄曲霉毒素中毒的诊治.吉林畜牧兽医.2004. 1期.P60 [7]食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定方法.中国国家标准:GB/T5009.24-1996.
