实验1 毛细管气相色谱法测定混合烷烃样品
一、目的要求
1. 了解6820气相色谱仪的基本结构及工作原理。 2. 了解色谱定性的基本原理。
3. 熟悉分离度的定义、计算及判据。
二、实验原理
色谱法的实质是分离分析。它根据混合物各组分在互不相溶的两相——固定相与流动相中分配能力、吸附能力等性能的差异作为分离依据。当各组分随流动相渗漉通过固定相时，在流动相与固定相之间进行反复多次的分配，结果使那些分配系数仅有微小差异的组分在色谱柱中的移动距离产生了较大的差别，从而得到分离。
物质在一定得色谱条件下具有一定的保留值，故保留值可以作为一种定性指标。色谱定量的依据是峰高或峰面积。当操作条件一定时，组分的质量（或浓度）与检测器响应讯号成正比。判断色谱柱分离效能的指标是分离度，其定义式为：
Rs=2（tR2-tR1）/（W1+W2）
式中，tR为保留时间，W为基线宽度，二者均可由色谱流出曲线得到。
三、仪器与试剂
仪器： 6820气相色谱仪，FID检测器（Agilent），氮、氢、空气体发生器，稳压电源，微量进样器，定性滤纸
试剂： 混合烷烃样品
四、实验步骤
1. 色谱条件
色谱柱：DB-1，15 m×0.53 mm；
柱温：80℃，梯度：15 ℃/min；气化室温度：250 ℃；FID温度：300 ℃； 载气：高纯氮，分压表0.4 MPa，流量：410 mL/min。 2. 混合样品的分离测定
（1）注册样品——样品/编辑/注册样品。
（2）进样——混合样品0.2μL/后进样口/手动进样。
五、结果处理
1. 方法/输出/报告规格/面积百分比/打印。 2. 计算分离度。
六、思考题
1. 气相色谱如何定性？ 2. 分离度有何意义？
3. 气相色谱中柱温的选择原则是什么？
4. 分流与不分流进样各适用于何种情况？应注意哪些问题？
实验2 气相色谱－质谱联用法测定环境样品中的多环芳烃
一、实验目的
1. 掌握GC-MS工作的基本原理； 2. 了解GC-MS联用仪的基本操作； 3. 初步学会质谱图的解析。
二、实验背景
1. 气相色谱（GC）
GC是一种分离技术。在实际工作中要分析的样品通常很复杂，因此，对含有未知组分的样品，首先必须要将其分离，然后才能对有关组分做进一步的分析。混合物中各个组分的分离性质在一定条件下是不变的，因此，一旦确定了分离条件，就可用来对样品组分进行定量分析。
GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在气化室气化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有固定相，由于样品中各个组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。由于载气在流动，使得样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附／解吸，结果是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱进入检测器，检测器将样品组分的存在与否转变为电信号，电信号的大小与被测组份的量或者浓度成比例，这些信号放大并记录下来就成了通常我们看到的色谱图。（分析流程见下图）
载气样品
进样器色谱柱分离检测器信号记录
2. 质谱（MS）
质谱法是通过将样品转化为运动的气态离子并按照质荷比（m/z）大小进行分离记录的分析方法，根据质谱图提供的信息可以进行多种有机物及无机物的定性定量及结构分析。其早期主要用于分析同位素，现在已经成为鉴定有机化合物结构的重要工具之一。MS可以提供分子量信息以及丰富的碎片离子信息，从而根据碎裂方式和碎裂理论深入研究质谱碎裂机理，为分析鉴定有机化合物结构提供数据，对于离子结构对应的分子组成、精确质量的测定可以给出有力的证明。对于一个未知物而言可以在一定程度上通过质谱来确定其可能的结构特征。
本实验用的仪器是电子轰击离子源（离子源为灯丝（70 eV），可以发出电子），有机化合物在高真空中受热气化后，受到具有一定能量电子束轰击，可使分子失去电子而形成分子离子。这些离子经离子光学系统聚焦后，进入离子阱质量分析器，通过射频电压扫描，不同质荷比的离子相继排出离子阱而被电子倍增器检测。
3. 气质联用（GC-MS）
色谱法对有机化合物是一种有效的分离分析方法，但有时候定性分析比较困难，而质谱法虽然可以进行有效的定性分析，但对复杂的有机化合物就很困难了，因此色谱法和质谱法的结合为复杂的有机化合物的定量、定性及结构分析提供了一个良好的平台。
气质联用仪是分析仪器中较早实现联用技术的仪器，在所有联用技术中气质联用发展最完善，应用最为广泛。二者的有效结合即充分利用了气相色谱的分离能力，又发挥了质谱定性的专长，优势互补，结合谱库检索，对容易挥发的混合体系，一般情况下可以得到满意的分离及鉴定结果。目前从事有机物分析的实验室几乎都把GC-MS作为主要的定性确认手段之一，另一方面，目前市售的有机质谱仪均能和气相色谱联用。
气相色谱仪分离样品中各个组分，起着样品制备的作用；接口把气相色谱流出的各个组分送入质谱仪进行检测；质谱仪对接口引入的各个组分进行分析，成为气相色谱的检测器；计算机系统控制气相色谱、接口和质谱仪，进行数据采集和处理。
下图是GC-MS联用仪的组成。
大气真空系统气相色谱接口离子化质谱计检测器分析结果
气相色谱－质谱联用法（GC-MS）是一种高效能、高选择性、高灵敏度的分离分析方法。质谱检测模式有全离子扫描(SCAN)模式和选择离子扫描(SIM)模式,气相色谱-质谱联用选择离子检测(GC-MS-SIM)常被用作定量分析,且能提高灵敏度,降低样品浓度检测限。
4. 多环芳烃
多环芳烃( PAH )普遍存在于人为因素及自然因素产生的环境污染物中。PAH主要是在煤、石油等矿物性燃料不完全燃烧时产生的,主要的工业污染源是焦化、石油炼制、炼钢等工业排放的废水和废气。PAH 具有化学结构稳定、较好的疏水性及容易在生物体内积累等特点, 一旦形成就很难降解。这类化合物中已有不少被确定或怀疑具有致癌或致突变作用， 所以日益引起人们的关注，PAH一直是分析化学界的研究重点。建立一种精确的、高回收率并且低不确定度的测定环境样品中PAH s的方法, 显得尤为重要。在各种水中的最高允许浓度为：地下水50 μg·L-1;地面水1 μg·L-1;废水100 μg·L-1。
目前国内外分离和测定多环芳烃PAH的主要方法有薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法(HPLC)。HPLC 测定PAH,不需高温,对某些PAH的测定具有较高的分辨率和灵敏度,柱后馏分便于收集进行光谱鉴定等优点,所以近年来,HPLC法广泛用于PAH的测定。
三、实验原理
1. GC-MS联用中主要的技术问题
（1）仪器接口
通常色谱柱的出口端为大气压力，这一状态与质谱仪中的高真空系统不相容，因此，接口技术要解决的问题就是如何使气相色谱仪的大气压工作条件和质谱计的真空工作条件的联接和匹配。接口要把气相色谱柱流出物中的载气，尽可能多的除去，保留或浓缩待测物，使近似大气压的气流转变成适合离子化装置的粗真空，并协调色谱仪和质谱计的工作流量。
（2）扫描速度
没与色谱仪联接的质谱计一般对扫描速度要求不高。和气相色谱仪联接的质谱计，由于气相色谱峰很窄，有的仅几秒钟时间。一个完整的色谱峰通常需要至少6个以上数据点。这样就要求质谱仪有较高的扫描速度，才能在很短的时间内完成多次全范围的质量扫描。另一方面，要求质谱计能很快地在不同的质量数之间来回切换，以满足选择离子检测的需要。
2. GC-MS分析条件的选择
GC/MS分析条件要根据样品进行选择，在分析样品之前应尽量了解样品的情况，比如样品组分的多少、沸点范围、分子量范围、化合物类型等。这些是选择分析条件的基础。一般情况下样品组成简单，可以使用填充柱；样品组成复杂，则一定要使用毛细管柱。根据样品类型选择不同的色谱柱固定相，如极性、非极性和弱极性等。与气相色谱中的分析一样，气化温度一般要高于样品中最高沸点20～30 ℃。柱温可根据样品的具体情况来设定，如有必要也可采用程序升温技术，选择合适的升温速率，以使各组分都实现基线分离。有关GC/MS分析中的色谱条件与普通的气相色谱条件相同。质谱条件的选择包括扫描范围、扫描速度、灯丝电流、电子能量、光电倍增器电压等。扫描范围就是可以选择分析器的离子的质荷比范围，该值的设定取决于欲分析化合物的分子量，应该使化合物所有的离子都出现在设定的扫描范围之内。扫描速度视色谱峰宽而定。
一个色谱峰出峰时间内最好能有7～8次质谱扫描，这样得到的重建离子流色谱图比较圆滑，一般扫描速度可设在0.5～2 s扫一个完整质谱即可。灯丝电流一般设置在0.20～0.25 mA。灯丝电流小，仪器灵敏地太低；电流太大，则会降低灯丝寿命。电子能量一般为70 eV，标准质谱图都是在70 eV下得到的。改变电子能量会影响质谱中各种离子间的相对强度。如果质谱中没有分子离子峰或分子离子峰很弱，为了得到分子离子，可以降低电子能量到15 eV左右。此时分子离子峰的强度会增强，
但仪器灵敏度会大大降低，而且得到的不再是标准质谱。光电倍增器电压与灵敏度有直接关系。在仪器灵敏度能够满足要求的情况下，应使用较低的光电倍增器电压，以保护倍增器，延长其使用寿命。
3. GC-MS分析技术
GC/MS分析的关键是设置合适的分析条件。使各组分能够得到满意的分离，得到很好的重建离子色谱图和质谱图，在此基础上才能得到满意的定性和定量分析结果。GC/MS分析得到的主要信息有3个：样品的总离子流图或重建离子色谱图；样品中每一个组分的质谱图；每个质谱图的检索结果。此外，还可以得到质量色谱图、三维色谱质谱图等。对于高分辨率质谱计，还可以得到化合物的精确分子量和分子式。
（1）总离子流色谱图
在一般GC/MS分析中，样品连续进入离子源并被连续电离。分析器每扫描一次(比如: 1s)，检测器就得到一个完整的质谱图并送入计算机存储。由于样品浓度随时间变化，得到的质谱图也随时间变化。一个组分从色谱柱开始流出到完全流出大约需要10 s左右。计算机就会得到这个组分不同浓度下的质谱图10个。同时，计算机还可以把每个质谱图的所有离子相加得到总离子流强度。这些随时间变化的总离子流强度所描绘的曲线就是样品总离子流色谱图或由质谱重建而成的重建离子色谱图。总离子流色谱图是是由一个个质谱得到的，所以它包含了样品所有组分的质谱。它的外形和由一般色谱仪得到的色谱图是一样的。只要所用色谱柱相同，样品出峰顺序就相同，其差别在于，重建离子色谱所用的检测器是质谱仪，而一般色谱仪所用检测器是氢焰、热导等。两种色谱图中各成分的校正因子不同。
（2）质谱图由总离子流色谱图可以得到任何一个组分的质谱图。一般情况下，为了提高信噪比，通常由色谱峰峰顶处得到相应质谱图。但如果两个色谱峰有相互干扰，应尽量选择不发生干扰的位置得到质谱图，或通过扣本底消除其他组分的影响。
（3）质量色谱图 总离子色谱图是将每个质谱的所有离子加合得到的色谱图。同样，由质谱中任何一个质量的离子也可以得到色谱图，即质量色谱图。由于质量色谱图是由一个质量的离子得到的，因此，其质谱中不存在这种离子的化合物，也就不会出现色谱峰，一个样品只有几个甚至一个化合物出峰。利用这一特点可以识别具有某种特征的化合物，也可以通过选择不同质量的离子做离子质量色谱图，使正常色谱不能分开的两个峰实现分离，以便进行定量分析。由于质量色谱图是采用一个质量的离子作图，因此进行定量分析时，也要使用同一离子得到的质量色谱图进行标定或测定校正因子。
四、仪器及试剂
1.仪器：
GCQ气相质谱联用仪 1台；毛细管气相柱（30 m×0.25 mm×0.25 um） 1个； 微量注射器（10 μL） 2支。
2.试剂：
标准样品：多环芳烃混合样品：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并（B）荧蒽、苯并（K）荧蒽、苯并芘、茚并芘、二苯并蒽、苯并（g,h,i）苝；测试样品：环境中萃取出来的多环芳烃混合物。
五、实验步骤
1. 编制气相色谱实验条件和质谱条件
有关GC/MS分析中的色谱条件与普通的气相色谱条件相同。质谱条件的选择包括扫描范围、扫描速度、灯丝电流、电子能量、光电倍增器电压等。扫描范围就是可以选择分析器的离子的质荷比范围，该值的设定取决于欲分析化合物的分子量，应该使化合物所有的离子都出现在设定的扫描范围之内。扫描速度视色谱峰宽而定，一个色谱峰出峰时间内最好能有7～8次质谱扫描，这样得到的重建离子流色谱图比较圆滑，一般扫描速度可设在0.5～2 s扫一个完整质谱即可。灯丝电流一般设置在0.20～0.25 mA。灯丝电流小，仪器灵敏地太低；电流太大，则会降低灯丝寿命。电子能量一般为70 eV，标准质谱图都是在70 eV下得到的。改变电子能量会影响质谱中各种离子间的相对强度。
如果质谱中没有分子离子峰或分子离子峰很弱，为了得到分子离子，可以降低电子能量到15 eV左右。此时分子离子峰的强度会增强，但仪器灵敏度会大大降低，而且得到的不再是标准质谱。光电倍增器电压与灵敏度有直接关系。在仪器灵敏度能够满足要求的情况下，应使用较低的光电倍增器电压，以保护倍增器，延长其使用寿命。
2. 进样操作
优化一个GC条件来测定环境中萃取出来的多环芳烃。
3. 图谱搜索与解析
从标准样品图谱中寻找并确定目标化合物；实际样品中鉴定不同的多环芳烃。
六、实验指导
1. 数据处理
（1）利用质谱图对色谱流出曲线上的每一个色谱峰对应的化合物进行定性鉴定；
（2）利用标准品对环境中萃取出来的多环芳烃混合物中的每一种多环芳烃进行定量分析。
2. 使用仪器注意
（1） 开机时，请确保先开气阀，再开主机电源。每次开机后请先确认一下真空泵工作正常，以确保仪器正常工作，发现有故障，应停机检查。
（2） 小心不要碰到GC进样口，以免烫伤！
（3） 不要随意按动仪器面板上的按纽，以免出现不可预知的故障与危险，否则酌情扣分。 （4） 做实验之前请认真预习相关知识，可参考教材中的色谱法引论、气相色谱法和质谱法中的相关内容。
（5） 当操作者错误操作或其它干扰引起微机错误时，可重新启动计算机，但无须关电源。 （6） 进样时要使针头垂直插入进样口，小心不要把进样针弯折。 （7） 多环芳烃多有致癌作用，请同学们实验完毕及时洗手。 （8） 仪器运行环境需保护清洁。不使用时请加防尘罩。
（9） 为延长气质联用仪使用寿命，实验完毕后要关闭离子室的电源（system off），不关主机电源。
七、实验拓展
本实验进行了GC-MS技术测定多环芳烃，既发挥了色谱法的高分离能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。这种技术适用于作多组分混合物中未知组分的定性鉴定；可以判断化合物的分子结构，可以准确地测定未知组分的相对分子质量；可以修正色谱分析的错误判断；可以鉴定出部分分离甚至未分离开的色谱峰等等。因此日益受到重视，现在几乎全部先进的质谱仪器都具有进行联用的气相色谱仪，并配有计算机（化学工作站）。
GC/MS联用在分析检测和研究的许多领域中起着越来越重要的作用，特别是在许多有机化合物常规检测工作中成为一种必备的工具。如环保领域在检测许多有机污染物，特别是在一些浓度较低的有机化合物，如二噁英等标准方法中就规定用GC/MS；药物研究、生产、质控以及进出口的许多环节中都要用到GC/MS；法庭科学中对燃烧、爆炸现场的调查，对各种案件现场的残留物的检验，如纤维、呕吐物、血迹等的检验与鉴定，无一不用到GC/MS；工业生产的许多领域，如石油、食品、化工等行业都离不开GC/MS；甚至竞技体育运动中也用GC/MS来进行兴奋剂的检测。
八、实验思考
1. GC/MS联用系统一般有哪几个部分组成？
2. GC/MS联用中要解决哪些问题？常用的接口有哪几种？ 4. 质谱仪的主要功能是什么？如何达到这个目的？
