常见流式项目检测(SOP)
CD55/CD59测定
方法
流式细胞仪(BD FACScanto ll ) 原理：
双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的单克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．溶血样本不能用。 试剂
品牌 剂型 规格 贮存 BD
1，单克隆抗体 液体 1ml 2—8℃ 2，全血溶血试剂 液体 100ml 室温 3，鞘液 液体 20L 室温 4，清洗液 液体 5L 室温
5，荧光微球 液体 10ML 2-8℃质控品 BD公司产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次；遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BD FACScanto ll 样本制备:
(一)白细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记；分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul；分别向二管中加入样品100ul；避光15-20分钟。
2．溶血： BD FACSLysing(按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用) 稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul 混匀避光室温溶血8-10分钟。 3．用PBS洗涤离心 ； 4．上机测样；
(二)红细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记
2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。
3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光15-20分钟。 4．洗涤离心。
5．混匀、上机测样。 报告结果 报告百分数 操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 参考值
CD55>97% CD59>97%
PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90%
PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒细胞CD59>84% 临床意义
用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。
HLA-B27测定
方法
流式细胞仪(BD FACScanto ll ) 原理：
双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。 试剂
品牌 剂型 规格 贮存 BD
1，单克隆抗体 液体 1ml 2—8℃ 2，全血溶血试剂 液体 100ml 室温 3，鞘液 液体 20L 室温 4，清洗液 液体 5L 室温 5，荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BD公式产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BD FACScanto ll 样本制备：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE) 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育15-20分钟
4)溶血： BDFACSLysing(按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用) 稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul 混匀避光室温溶血8-10分钟。
5)用PBS洗涤、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）
报告结果 报告阴阳性
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 参考值
阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。 临床意义
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
方法
流式细胞仪(BD FACScanto ll ) 原理：
直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。
4．溶血样本不能用。 试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。 单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC选自美国BD公司。
质控品 BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BD FACScanto ll 操作：
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C02 37℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。
流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞； ●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； ●B门内TH细胞亚群分布： 1区数值---Th 1细胞 (%) 4区数值---Th 2细胞 (%) 2区数值---Th 0细胞 (%) 报告结果 报告百分数 操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 正常参考值
Thl(IFN-γ)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50±0.44% ThO ：0.51±0.26% 临床意义
