（2）准确称取Cu(Ac)2.H2O和FeCl3，先在烧杯中用少量水溶解，然后转移到容量瓶中定容，配成2mM，室温保存。
（3）100mM磷酸盐缓冲液：7.16gNa2HPO4.12H2O溶于200mL水中，调pH为7.0（大约需要加入浓盐酸600uL）。
（4）100 m mol/L NaNO2溶液：称取0.69 g NaNO2，先在烧杯中用少量水溶解，二次水定容至100 mL。
（5）100 m mol/L H2O2溶液：取30% H2O2 11.1 μL，加入990μL的二次水中。 （6）1 mol/L NaOH溶液：称取8 g NaOH，二次水定容至200 mL。 2、金属离子与蛋白质相互作用的紫外吸收光谱测定
试管中固定BSA的浓度为1.0mg/mL，加入不同浓度的Cu2+和Fe3+溶液，使终浓度分别为0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0（×10-5M），补加相应磷酸盐缓冲溶液。37℃恒温水浴中反应30min。以磷酸盐缓冲溶液做参比，扫描200-400nm范围内的紫外吸收光谱，2nm取一点。
分组 BSA（mL） Cu2+（mL） 缓冲溶液（mL） 1 0.4 0 0 2 0.4 0.04 3.6 3 0.4 0.08 3.6 4 0.4 0.16 3.5 5 0.4 0.24 3.4 6 0.4 0.32 3.3 7 0.4 0.4 3.2 3、Cu2+-NO2--H2O2和Fe3+- NO2--H2O2体系导致BSA蛋白质硝化的可见光谱测定 （1）蛋白质硝化
蛋白质硝基化（protein nitration）主要指的就是蛋白质中酪氨酸的硝化反应。酪氨酸中含有酚基，硝化反应也正是发生在酚基的苯环上。如图：
HONH2HO-HOOOOHON+NH2C9H10N2O53-nitro-tyrosineOC9H11NO3tyrosine
含有酚羟基的苯环上所发生的硝化反应可由两种途径得到：一种是硝鎓离子NO2+的亲电取代反应，NO2+具有线形结构，亲电性很强：
Protein-Tyr + NO2+ = Protein-Tyr-NO2 + H+
另一种反应途径就是自由基反应，这是更接近生物体系的一种反应形式。自由基的定义为：“任何包含一个未成对电子的原子或原子团，均称之为自由基”。自由基具有反应性强、顺磁性和寿命短的特点。当生物体系中自由基产生过量时就会带来一系列的不良反应，引发一定条件下的病理过程。 （2）蛋白质硝化的检测方法
最简单的硝基酪氨酸定量检测方法是分光光度法，其原理主要是基于3-硝基酪氨酸稳定存在，且在280到450nm波长范围有最大吸收。在酸性条件（pH<3.5)硝化酪氨酸和酪氨酸在280nm和365nm处均有最大吸收；在碱性条件（pH>9.5左右）硝化酪氨酸在430nm有最大吸收，因此可以依据吸收光谱来计算硝基酪氨酸的浓度。
（3）、实验方案
按照加样表加样后，37℃水浴温浴30 min。反应后取2 mL反应液，加入200 ?L 1 mol/L的NaOH溶液，在430 nm处测定吸光度。
分组 BSA（mL） Fe3+（mL） Cu2+（mL） NO2-（mL） H2O2（mL） 缓冲溶液（mL） 1 0.6 0 0 0 0 5.4 2 0.6 0 0 0.06 0.06 5.4 3 0.6 0.06 0 0 0.06 5.4 4 0.6 0.06 0 0.06 0.06 5.4 5 0.6 0 0.06 0 0.06 5.4 6 0.6 0 0.06 0.06 0.06 5.4 五、实验要求：
4人一组
扫描得到紫外图谱，并进行简单分析。 蛋白质硝化数据作出柱状图形。 六、思考题
1、测定为什么要在37℃下进行？
2、缓冲溶液的pH为什么要保持在7.0-7.4？
