人的外周血淋巴细胞培养
摘 要： 正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1]
关键词： 外周血淋巴细胞 低渗处理 空气干燥法 染色体组型分析
前 言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。
1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使 细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染 色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈 现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3]
淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]
染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较 好的固定效果。
1.材料方法 1.1 材料
人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具
采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、 电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
1.3 药品
1.3.1 RPMI“1640”培养基
称取“1640”粉末 1.05 g，用 100 mL的双蒸水溶解，溶解后 pH 值调至 6.0。每1000 毫升溶液加NaHCO31.0克，校正PH到7.1。
1.3. 2 肝素
作为抗凝剂使用。称取该粉末8 mg（每mg含 126 单位）， 用 2 mL的生理盐水溶解，此溶液的浓度为 504 单位/mL。
1.3.3 生理盐水
用0.9克NaCL加入100mL蒸馏水中，配制溶液。 1.3.4 秋水仙素
作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素1mg，用25mL生理盐水溶解，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1mL注射器吸取该溶液0.1mL加入5mL的培养物中，其最终浓度为0.8微克/毫升。
1.3.5 植物凝血素（PHA）
是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的PHA粉末，一个针剂为0.2mL。将1瓶粉末溶在2mL的蒸馏水中。
1.3.6 抗菌素
青霉素（以每瓶 80 万单位为例）：将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中，则每毫升含10万单位。取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为1000单位/mL。
链霉素（以每瓶 100 万单位为例）：以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含100万单位，取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为100单位/mL。
1.3.7 吉姆萨染液 实验室中有现成染液 1.3.8 3.5%NaHCO3溶液 实验室有已配好的试剂。 1.3.9 0.1mol/L磷酸缓冲液 实验室有已配好的试剂。
2 方法步骤
2.1 分装培养液
用移液管将培养液和其他各试剂分装入培养瓶中，每瓶量为：
RPMI“1640”培养基 4mL 小牛血清 1mL PHA 0.2mL 双抗（青霉素加链霉素） 0.1mL
用3.5%NaHCO3溶液调pH到7.3，分装到20mL的培养瓶中，盖好盖子，用标签纸标清姓名，置于冰柜中保存。用前从冰柜内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。
2.2 采血
用酒精消毒手指皮肤，用采血针刺破皮肤，再用毛细管取血0.3mL全血，吹入瓶中,轻轻摇动几下，盖好盖子，直立置于37℃恒温箱内培养。
2.3 培养
置 37℃温箱内培养72 小时——这个时间恰好是白细胞分裂的两个周期。
2.4秋水仙素处理
培养终止前在培养物中加入浓度为40μg/mL的秋水仙素0.1mL，最终浓度为0.8μg/mL，置恒温箱中处理4h。
2.5 低渗处理
秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液(蒸馏水)5 mL，用 滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置 37℃温箱处理 20 min，使红细胞 破碎，白细胞膨胀。
2.6 离心
以1000r/min，离心 5min10s，弃去上清液，收集白细胞。 2.7 固定
加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶l，临时配制)3 mL， 片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液， 在室温中固定 15 min后， 离心， 吸去上清液，留下白细胞。
2.8 再固定
加入固定液 2 mL，用吸管轻轻打散，室温下继续固定 15min （过夜也可以） 。 2.9 再离心
以1000r/min，离心 5min10s，除去上清液，留下白细胞制片。 2.10 制片
用吸管吸取细胞悬液自1m高处，滴在从冰柜中取出的一块干燥洁净的载玻片上,每片滴加悬液 1—3 滴，用嘴轻轻吹散，在酒精灯火焰上微微烤干。
2.11 染色
用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释过的Geimsa 染色液(1︰10)染色 20min，然后倒去多余染液。并用蒸馏水轻轻冲洗。
2.12 镜检
待稍干后，在显微镜下观察。先用低倍寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。 选择染色体清晰、分散度好的细胞进行核型分析。
3 结果分析
3.1实验结果
该图为显微镜视野内所拍到的图
3.2 核型分析：人类每个体细胞有 46 条染色体，22 对常染色体和一对性染色体，男子是 46，XY；女子是 46，XX。可以将人的 46 条染色体分成 A、B、C、D、 E、F、G 七群，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。三个参数：（1）染色体的相对长度 （2）臂比率 （3）着丝点指数
4 分析讨论
4.1实验误差分析
实验利用的是植物凝血素(PHA)使停止分裂的细胞恢复分裂的原理来获得大量的有丝分裂细胞，从而便于对染色体经行观察。但淋巴细胞经过培养后，制成的标本质量不佳，染色体不明显,视野中除有染色体以外还有杂菌等,其原因可能为：
(1)未作灭菌处理，由于细胞培养是在37℃的环境中进行的，而此温度也是细菌繁殖的最适温度，所以杂菌会出现在视野中。
(2)秋水仙素处理不当，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。
(3)低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。
(4)低渗处理完后，细胞悬液可能并没有变浑浊，这有可能是用蒸馏水做低渗液没有使红细胞完全破裂，没有使白细胞充分的膨胀，从而会影响到观察的结果。
(5)在两次离心后，在离心管底没有看到明显的沉淀，有可能是培养基酸碱度没有调到最适的pH值或是培养时间短而导致白细胞量不足，从而影响了观察结果。
(6) 标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。
(7)载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流动而丢失。
(8)载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻
