实验一：环境中微生物的检测，细菌的简单染色，细菌的革兰氏染色
作业题：
1、为什么在培养过程中要将培养基平板倒置
答：倒置的原因为1、防止培养基水汽凝结后流下到培养基上，从而冲散菌落并造成多菌落的污染串染，不利于细菌菌落的计数统计；2、同时培养基倒置后，可以有效防止外部空气进入，防止杂菌污染培养基
2、为什么在实验中要留空白对照
答：预留空白对照组，可以通过观察空白对照组中菌落生长情况，排除可能的因操作原因造成的无关杂菌、无关变量的污染干扰。同时可以验证菌落生长长势不因为培养基制备的原因而产生误差。
3、比较测试培养皿和对照培养皿中的菌落数说明什么问题
答：测试培养皿和对照培养皿同时进行操作，可以通过观察对照空白培养皿中的菌落数，对照排除测试培养皿中因培养基制作或培养皿自身灭菌等操作误差引起的染菌因素。便于判定测试培养皿中哪些是来自环境中的微生物，哪些是来自于培养皿本身所携带微生物。 4、通过实验谈谈你对无菌操作的认识
答：通过第一次的实验，我们已经认识到环境中的微生物是无处不在的。在微生物实验中，只要不注意，就很有可能造成杂菌的污染而影响到正常实验。在实验课上我们学到的是最基本的无菌操作技术，而更重要的是树立无菌操作的意识，比如在操作的时候尽量不说话、不用手去触碰非无菌区域，对菌落进行接种时应该靠近火焰，操作完后再次在火焰上方灼烧消毒等等。
5、制片时为什么要固定？固定时应该注意什么事项？ 答：制片时固定的意义在于防止后期在染色和冲洗玻片时细菌会随着流水冲散甚至冲走，造成制片失败。固定时应注意不应直接将玻片放于酒精灯外焰灼烧，否则会造成细菌因迅速脱水而无法顺利固定在玻片上。同时不能灼烧过度否则会造成细菌缩水变形。 6、在使用和清理油镜过程中应注意哪些过程？
答：油镜属精密仪器，需轻拿轻放并不能将镜子反向放置。在使用前，需对油镜用擦镜纸的光面蘸取少量松柏油擦拭油镜镜头，同时在样品玻片上样品处滴加少量松柏油。放置好后调至油镜，先调节粗准焦螺旋待其离样本距离很近时，换用细准焦螺旋调节，待其与样本上松柏油接触形成一条油线。通过调节细准焦螺旋进行观察以免压坏镜头。
使用完后先调节粗准焦螺旋升起镜头，然后用擦镜纸的光面蘸取少量二甲苯擦拭油镜镜头，后再取擦镜纸蘸取少量松柏油擦拭油镜镜头。然后将油镜镜头摆置高处放置。 7、革兰氏染色的关键步骤是什么？为什么？应当如何控制？
答：第三步酒精脱色。因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性；如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。应当在用酒精脱色过程中不断观察玻片颜色变化，并适时用蒸馏水进行润洗以防脱色过度；同时严格控制脱色时间。
8、当需要对一株未知菌进行革兰氏染色时，应从哪些方面注意控制条件，才能保证对君主的染色结果可靠？
答：（1）要同时做一张革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的混合涂片，用作对照。
（2）注意脱色时间。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可能被误认为是革兰氏阳性菌。
（3）注意染色所用细菌的菌龄，要选用处于对数生长期的菌体。如菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验一 环境中微生物的检测与细菌的革兰氏染色
杨明轩 生物111 1102040128
一、实验目的
1、用实验证明生活环境中存在各种微生物，了解无菌操作的重要性。 2、学习并掌握细菌的简单染色和革兰氏染色法。 3、学习并掌握油镜的工作原理及正确的使用方法。
二、实验原理
（一）环境中微生物的检测
微生物是一类形态结构多样的生物体，广泛存在于我们生活的环境中，其中大部分存在于土壤中。在不借助显微镜的条件下，多数微生物肉眼不可见。有些微生物对人类及其他生物有益，而有些则往往能引起工农业产品及实验室中各种实验材料的污染。在实际工作中，必须牢固建立起无菌操作的概念，熟练掌握各种微生物操作技术，防止杂菌污染。
在我们生活的环境中存在着种类繁多的微生物，在适宜的温度下，将这些微生物接种到适合于它们生长的固体培养基表面，经过一段时间，即可有单个菌体或孢子生长、繁殖形成一个个肉眼可见的菌落。根据不同菌落形态上的不同，可以初步分辨出不同类型的微生物。 （二）细菌的革兰氏染色
细菌的革兰氏染色法是1884年有丹麦病理学家Christain Gram创立的，可以将细菌区分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上比较重要和广泛应用的鉴别染色法。其基本步骤是结晶紫初染、碘液媒染、乙醇脱色、番红复染。
细菌的细胞壁成分和结构不同，因而对革兰氏染色产生的反应不同。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网格状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而使网状结构的孔径缩小，细胞通透性降低，结果使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因而呈现蓝紫色。相反，革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，因而导致细胞壁通透性增加，并使结晶紫-碘复合物容易被乙醇脱色，最后被染上复染液番红的颜色，因而成红色。
革兰氏染色法的结果不仅与乙醇脱色程度有关，同时也与菌龄密切相关，通常用处于对数生长期的菌体进行染色。若菌龄过老，可能导致革兰氏阳性菌被染成阴性。
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），37℃培养12~16小时（未污染）
大肠杆菌（Escherichia coli），37℃培养12~16小时（有污染）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），37℃培养16~18小时 2、染料：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染液
3、其他：7套无菌培养皿、150ml细菌培养基（LB）、载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具
四、实验方法
（一）环境中微生物的检测 1、接种
（1）取一套培养基平板，不打开，作为对照组。编号为7，注明为对照，以“CK（check）”表示。
（2）取另外四套培养基平板，依次编号为1、2、3、4、5、6。打开皿盖，分别作如下处理：咳嗽处理、在空气中放置20min、用手指按压培养基表面、衣服袖口按压培养基表面、钱币按压培养基表面、头发按压培养基表面。盖好皿盖，并分别注明处理方式。
2、将所有培养皿倒置，与28℃温箱中培养一周，观察结果。 （二）细菌的革兰氏染色
1、涂片：取一洁净的载玻片，在两端和中央各滴一滴无菌水。以无菌操作法分别取少量大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在两侧的水中涂菌，并在中间的水中进行混合涂菌。干燥固定。
2、染色：
（1）初染：加草酸铵结晶紫染液各一滴覆盖于涂片处约1min，水洗； （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，水洗；
（3）脱色：倾斜载玻片，并衬以白背景，用95%乙醇冲洗至流出的乙醇不带紫色为止，立即用水冲净乙醇； （4）复染：用番红染液覆盖1min（可适当延长时间至2min），水洗，风干； （5）镜检：干燥后置于油镜下观察；
（6）清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。
五、实验结果
1、对环境微生物的观察记录
处理方式 咳嗽 空气 指头 衣服 钱币 71 7 28 6 ∞ 6 25 6 菌落数 48 菌落种数 3 菌落类型 ① ② ③ ① ② ③ ① ② ③ ① ② ③ ① ② ③ 大小 1.1cm 0.1cm 0.1cm 6.5cm 0.1cm 0.01cm 0.01cm 0.02cm 0.01cm 4.5cm 1.8cm 0.01cm 7.1cm 3.2cm 1.5cm 形态 不规则扁平 圆形凸透镜 圆形凸透镜 丝状隆起 圆形凸透镜 点状凸透镜 圆形隆起 圆形凸透镜 不规则扁形 不规则扁形 圆形脐凸状 圆形凸透镜 圆形扁平 圆形垫状 圆形凸透镜 表面干湿 干 湿 湿 干 湿 湿 湿 干 干 干 干 湿 干 干 湿 颜色 白 黄 白 白泛黄 黄 红 黄 白 白 白 白泛黄 金黄 白 金黄 白 边缘 波状 完整 完整 丝状 完整 完整 完整 完整 波状 裂片状 完整 完整 啮蚀状 波状 完整 头发 CK 28 3 ① ② ③ 4.1cm 2.0cm 1.8cm 0 扁平 圆形脐凸状 圆形脐凸状 0 湿 湿 湿 0 白 白 金黄 0 波形 完整 完整 0 0 0 0 通过上面的数据得知，环境中的微生物是无处不在的。相对来说，空气中的微生物较少，而桌面、人体表面的微生物则较多。同时，我们应当注意到，并不是所有的微生物都能够在我们所使用的培养基和培养条件下生长的，实验中观察到的微生物仅仅是真实存在的微生物中的一部分而已。
然而对于微生物实验操作，即便是空气中微量的未知微生物的沾染都会造成对目标微生物培养的严重影响，甚至会导致目标微生物的变异或死亡，对实验结果造成无法估量的影响。因此在做微生物实验的时候必须严格树立无菌操作的意识，确保实验结果的准确性。
因此对于微生物实验的结果的可靠性，我们应该保证1、根据上述实验中手上微生物的检测，在做微生物实验前应洗手，并在接触培养皿等容器前用75%的酒精处理消毒。尽量减少手对培养皿的接触；2、树立无菌意识，对于有可能沾染有外来微生物的器皿或仪器应及时在酒精灯上灼烧达到灭菌处理的效果；3、保证周围环境的相对恒定，做实验的时候周围不应或尽量少站人，根据上述实验中咳嗽的微生物很多且很容易生长，会对实验结果造成很大的影响。因此如有可能应尽量在人少或超净工作台里工作。4、对于接种环等经常接触不同微生物的仪器应随时用酒精灯进行灼烧或者用紫外线进行消毒处理，以防上一批细菌对下一批的实验造成干扰。5、因为实验室中大量的微生物属未知微生物，且可能会因实验条件而产生有害变异，因此在实验结束后应用75%的酒精棉球及时擦拭手及可能接触到的皮肤，以防微生物进入体内造成病害。
2、细菌的革兰氏染色情况
菌名 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
菌体颜色 红色 蓝紫色
G或GG +G
-+- 表2 细菌的革兰氏染色
注：本次实验中使用的大肠杆菌培养管中因前期实验准备中，混入杂菌导致在对大肠杆菌做革兰氏染色时发现在红色细菌周围有存在蓝紫色的革兰氏阳性菌。
对于革兰氏染色法，本次实验中主要问题是如何把握控制涂菌的密度。在接种环蘸取菌落时不应涂抹过多菌体，以防在后续观察染色时造成细菌重叠现象，从而对观察细致结构造成困难。解决方法为用接种环一次性从菌落表面刮取一次菌落即可，然后在无菌水里充分铺匀摊开，避免细菌之间的重叠。
