细胞工程
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第一章 绪论
1、细胞工程的定义及特点？
细胞工程（cell engineering）：是指主要以细胞为对象，应用生命科学的理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞，组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。 细胞工程的特点：前沿性：现代生物技术的热点
争议性：新技术给伦理道德带来的冲击 综合性：多学科交叉
应用性：工程类课程，重在产品与技术
第二章 细胞培养的设施与基本条件：
1、什么是细胞及组织培养？ 组织工程（tissue culture）：习惯上繁殖所有的体外培养，即器官培养，组织培养和细胞培养的总称。其本意是指从活的机体中去取出器官、组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、室温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能能的技术称为组织培养。
细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，活在培养液中呈悬浮转肽培养的技术称为细胞培养。 2、了解细胞培养实验室的基本规划及相关注意事项？
实验室规划：⑴ 准备室：培养用具清洗、消毒和做实验准备的场所，一般建在通风和光线充足的地方（阳面）。 ⑵ 缓冲间：保护操作室的无菌环境，避免空气对流。
⑶ 操作间：要求无菌。最好设在阴面，防止室温过高；天花板高度不超过2米，保证紫外线有效杀
菌效应；门用拉门，避免空气流动。室内天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，便于清洗与消毒，不易在墙角推挤灰尘。
3、细胞培养的设备有哪些？有何基本作用
⑴ 超净工作台 ①最好安装在无尘室内，最好在无菌间，避免过多灰尘使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。 ②新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和其周围环境用真空吸尘器或不产生纤维
的工具进行清洁工作，在采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。
③每次使用时，应先用75%酒精擦洗台面，并进行30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内累积的微生物，在关闭紫外灯后，应启动送风机使之转运2min后在进行培养操作。 ④净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流不受干扰
⑤高效过滤器3年更换一次。请专业人员操作，以保持密封良好。定期将粗过滤器中的过布拆下
清洗。
⑥每次使用净化台要即使清楚工作台面上的物品，并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。
⑵ CO2培养箱：① 一定浓度的CO2生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。 ② 一定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH
③ 箱体内装有水域，可以保证培养箱内的湿度。 ④ 培养箱内装有紫外灯。
⑤ 通过气体流量计可以调节CO2还让空气的比例。 ⑥ 在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。
⑶ 电热干燥箱：用于烘干和干热消毒玻璃器皿。消毒时，由于温度高达160℃，因此一般不要随意打开箱门，以免
玻璃器皿突然遇到冷空气而破裂。要等到温度降低到50℃以下时，才能打开门。
⑷其他：蒸汽消毒器、冰箱、离心机、真空泵、纯水设备、滤器、液氮容器、显微镜、天平、移液器等。
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第三章 植物组织培养
1、细胞全能性（totipotency）：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信
息，具有发育成完整个体的潜能。 2、细胞分化（differentiation）：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。 3、脱分化（dedifferentiation）：又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能能变为未分化细胞特性的过程，
即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。
4、愈伤组织(Callus)：脱分化的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构，无明显极性的松散的细胞团。 5、再分化（redifferentiation）：是指在立体条件下，无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。植物再生的理论基础是细胞的全能性。
6、外植体：由特殊形态结构和生理功能的已分化细胞组成的。从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官。 7、植物组织培养：无菌条件下，在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，对立体植物组织（器官、组织和细胞）
进行培养、并诱导使其长成完整止住的技术。
8植物细胞培养：是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增值，获得大量细胞群体的一种技术。
9、继代培养：将愈伤组织重新转移到成分相同的新鲜培养基上的过程称为继代，愈伤组织将在不同的培养基上分化形
成小芽或根，进而形成小苗。
11、植物再生的理论基础：细胞全能性（是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全
部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能）。 12、植物组织培养的再生途径有哪两种？
⑴ 器官发生途径：成熟细胞---愈伤组织---出根出芽---完整植株。
（离体的植物器官、组织、细胞--------愈伤组织--------根芽----植物体） ⑵ 体细胞胚发生途径：成熟细胞----分生细胞-----胚状体----完整植株。 13、激素在细胞分化中是如何调节器官分化的？植物激素控制器官形成。
生长素/细胞分裂素：高 ：有利于根和愈伤组织形成 ；适中：有利于根芽的分化；低 ：有利于芽的形成 14、总结植物组织培养的主要操作步骤(4步)
① 植物组织的实验条件 ② 实验材料的清洗和消毒 ③ 培养基 ④ 灭菌 ⑤ 原代培养 ⑥ 继代培养 15、生长素：由色氨酸通过一系列中间产物形成的。
作用：主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化 常用生长素：吲哚乙酸（IAA）、2、4—二氯苯氧乙酸（2、4—D），萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBV）等。 16、细胞分裂素：大多是嘌呤族衍生物
作用：主要用于诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大 主要细胞分裂素：激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。 其中最常用的是6-苄基腺嘌呤（BA）。其中ZT活性最强，但昂贵，常用的是6-BA。 17、植物细胞几种大规模培养系统各有什么特点？
⑴悬浮细胞培养：在愈伤组织体液培养的基础上发展起来，是指将单个有力细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养
增值的技术。
特点：细胞可以不断增值，形成高密度的细胞群体，斌且适于大规模培养，可大量提供较均匀的细胞，为深
入细致地研究细胞的生长、分化创造了一个很好的实验方法和条件。
⑵ 植物细胞固定化培养：把细胞固定在一种惰性基质上，如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺和纤维膜等，细胞不能运
动，而营养液可以在细胞间流动，供应细胞营养的培养方法。
优点 ①细胞经过包埋后所到的剪切力损伤减小，维持了细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利
于采用传统生物反应器大规模培养。
②悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加儿引起传质困难，固定化细胞培养系统中细胞密度
远高于悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传代。
③大多数植物次级代谢产物合成在生长停止后才大量合成。采用固定化培养可以将细胞生长与产物合成分
成两个阶段
④ 细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累；
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⑤固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物的合成； ⑥固定化细胞可以反复使用，可以方便的进行产物的连续性收获，降低了成本。
缺点：①固定化细胞培养要求代谢产物必须是分泌到细胞外。但次级代谢产物多是存在于细胞内的，为促进次级
代谢产物的合成和分泌，需要借助表面活性剂或对细胞进行透性改造。
②植物细胞次级代谢产物的积累不是连续的，这也是限制了固定化细胞方法的应用。 ⑶ 植物器官培养：包括毛状根培养、芽培养、体细胞胚培养。
根据不同的培养体系，不同的培养目的，确定不同类型的生物反应器，是植物大规模培养技术应用的关键。 18、种质资源的三种保存方法：
⑴常温限制生长保存：是指在常温培养条件下，通过在培养基中加入化学物质或采用一些物理方法，限制或延缓
培养物生长，以达到保存种质的目的。如 添加生长抑制剂；提高培养基渗透压；降低培养瓶内氧分压；培养物干燥保存。
⑵中低温调控生长保存：应用中低温调控外植体生长量，在离体培养中是较为常用的保存方法。一般采用1~9℃
低温保存外植体（热带、亚热带植物在10~20℃之间也也能延缓外植体生长），这种方法适于包寻中短期的种质材料。
⑶超低温长期保存：在液氮（-196℃），几乎所有的细胞代谢活动、生长过程都停止了，仅保存细胞的活力和形态发
生的潜能。
第四章 植物的快速繁殖
1、什么是植物快繁技术？总结其主要步骤。
植物快速繁殖：是指利用组织培养技术，将优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，
在短期内获得大量遗传性状一致的植株的技术。
主要步骤：①无菌母体植株的植被 ②不定芽的增值 ③完整植株的形成 ④再生植株的驯化 ⑤再生植株的鉴定 ⑥
移栽
2、利用微茎尖培养进行植物脱毒的原理是什么？
带有病毒和其他病原微生物的植物，其病原体在植物体内的分布是不均匀的，越靠近生长点，病毒浓度越低。 3、哪些因素会影响微茎尖培养的脱毒效果？
起始培养茎尖体的大小；外植体的生理状态；母体材料病毒侵染的程度。 4、微繁殖中芽的增值方式有哪些？ ⑴ 侧芽（腋芽）途径：（原理）有的植物具有大量腋芽，由于顶端优势效应，这些腋芽的生长在整体植株上被顶芽
抑制。若将腋芽分离下来，给以适当的培养条件，即可形成大量的不定芽，进而再生为植株。
⑵器官发生途径：从器官外植体诱导不定芽。不定芽是指现存芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的
芽。
特点：繁殖系数高；遗传稳定性好；继代次数有限。 ⑶胚状体增值：（特点）增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。
目前除一些特殊用途（人工种子），这一途径还没有用于快繁技术。
5、不定芽：是指现存芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽。不定芽可以来源于外植体或经过从继代
的愈伤组织、不定根、外植体、或愈伤组织产生的休眠器官。
6、植物常用的脱毒方法：微茎尖培养法、株心组织培养法、热处理法。
第五章 植物原生质体融合技术
1、为什么说原生质体培养是现代生物技术的载体？
去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体。特点为：无细胞壁，可以方便的进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。是最简单的细胞形态，有许多优良的性质，在细胞工程方面有很多应用，可以说它是现在生物技术的载体。 2、细胞融合的原理、方法与关键环节？
原理：细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌、贯穿在其中及吸附在其表面的蛋白质组成的，磷脂双分子层疏水的尾部在
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内，亲水头部在外，具有一定流动性，蛋白质也是如此，即利用细胞膜具有流动性的原理。 方法：可以采用化学诱导剂，包括NaNO3、高pH的高浓度Ca2ˉ离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体等（P41
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物理法：电融合诱导法、BLS流式细胞融合仪、电击法。
主要环节：①亲本选择（单细胞或原生质体制备） ②两原生质体或细胞互相靠近，粘附 ③质膜融合形成细胞桥
④胞质渗透 ⑤细胞核融合 ⑥融合细胞筛选
关键环节：细胞核的融合。(若没有发生细胞核的融合，仅发生了细胞质的融合，则可能嵌合细胞。含有多个核的异
核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。细胞核的发生在有丝分裂过程中。但这种有丝分裂只有当两个核的DNA合成才能发生：两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，全部染色体都排列在一个赤道板上，结果伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，其细胞核中含有双亲细胞的染色体。) 3、细胞融合：是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。对于植物体也叫“原生质体融合”。
亲本细胞是体细胞，也叫“体细胞杂交”。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞，培育新品种方面意义重大。
4、原生质体：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体。特点为：无细胞壁，可以方便的进行遗传操作、人工诱变、
细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。
第六章 植物转基因技术
1、常见的基因转化技术有哪些？（针对植物）
⑴非生物学转化法：将裸露的DNA直接导入植物细胞的转化方法。这种裸露的DNA可以是全部或部分染色体，分离
的DNA也可以是基因工程的质粒；直接转化的成功率以来于人们所采取的离体培养方法，包括受体细胞的制备，以及后续的离体培养和筛选过程直至获得转基因植物 ⑵生物学的转化方法
①基因枪法：微弹为0.2—2微米的钨粉或者金粉，用超声波使外源DNA液均匀的包裹钨粉微粒，手枪原理射击。 ②电穿孔转化法：用短时高脉冲电处理可导致细胞膜出现可恢复性孔隙，产生3—4纳米的渗透点，为外源DNA进入细胞提供通路。
③PEG转化法：PEG转化法和PEG诱导原生质体融合方法相似，同样需要高钙、高pH条件从而将外源DNA插入原生质体并整合。
2、简述根瘤农杆菌进行基因转化的步骤及其原理。
原理：农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性菌，能在自然条件下趋化性的感染大多数的双子叶植物的受伤部位，
并诱导产生冠瘿瘤。根瘤农杆菌中的细胞含有Ti质粒，其上有一段T-DNA。农杆菌通过侵染植物的伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中；T-DNA上的基因利用植物的酶系统进行那个转录和翻译，其表达产物可诱导肿瘤形成。人们将目的基因插入到经过人工改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
根瘤农杆菌Ti质粒的基因结构主要分为T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区4个区段。T-DNA区称为转移DNA区。
能够转移整合入植物受体基因组，并不能在植物细胞中表达，从而导致冠瘿瘤发生。Vir区与T-DNA区相邻，由多个毒性基因组成，其编码蛋白对T-DNA的转移和整合必不可少。该基因可激活T-DNA的专一，使植物致瘤，故称毒性区。Con区段上存在与细菌结合转移有关的基因，调控Ti质粒在根癌农杆菌中的转移，故称为结合转移编码区。Ori区主要调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
步骤：⑴对植物表面部位的识别和附着：植物伤口分泌的酚类小分子物质可以诱导Vir基因活化并表达
⑵T-DNA进行复制和转移：Vir产物能诱导Ti质粒复制产生一新的单链T-DNA分子，并使其转移到植物细胞中。 ⑶T-DNA的整合：在Vir产物作用下，T-DNA转入细胞核，并整合到植物染色体上。
第七章 动物细胞培养
1、动物细胞体外生长有什么特点？
体外生长的动物细胞一般具有细胞接触性抑制、密度抑制的特点、贴附。
接触性抑制：是某些动物细胞体外培养的生长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象。由于
这个特性。正常细胞不会相互重叠，而呈单细胞生长。
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