1、 荧光显微镜是常用的细胞定性定量分析的光学仪器，请查阅文献详述其原理。 荧光显微镜技术在光学显微镜领域占有极为重要的地位。自1904年库列创建以紫外光为光源，激发出荧光，以观察细胞组织结构的方法以来，各国已开发出系列化的荧光显微镜产品，在医学和生物学的研究中获得了广泛的应用。
荧光显微镜是其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光从
而对样品的机构和组分进行定位、定量、定性观察检测。以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
荧光显微分析是通过观察与检测光学切片、单细胞中的自发荧光或是与信号分子相结合的荧光染料的荧光，并对其荧光特性进行分析的一种技术。它能在亚细胞水平观察细胞骨架的动态变化、细胞内特异蛋白的定位、PH和钙离子的浓度变化、细胞器的分布等，根据荧光特性不同进行细胞的分选、定量测定细胞内物质的含量并观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。 荧光显微分析方法灵敏度高，选择性好，试样量小，在细胞生物学研究中有着越来越广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较差，人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，利用荧光分析仪器对其进行监测分析。
普通荧光显微镜是荧光细胞化学的基本工具，突出优势表现在对活体材料的观测方面，而传统的光学显微镜绝大多数是对无生命活性的植物染色切片或单细胞进行观察拍照，电子显微镜的观察材料则是完全失活的植物材料，同时荧光显微镜又具备了植物体内自发荧光或是荧光标记的物质的观察与初步定位的功能，与放射性同位素标记相比，在对被测物质进行准确定位的同时，其安全性又大为提高。
普通荧光显微镜初期用于观察动植物标本的自然荧光，其灵敏度较低，并且不能定量的给出图像发光的强度数值。随着现代生物的发展，需求荧光显微镜给出一定精度定量数据，定量分析细胞内荧光物质的发光强度和空间分布。在普通荧光显微镜的基础上加上能够定量测定细胞内荧光物质的附件即可进行定量研究。高灵敏度的荧光显微镜是在普通显微镜上加上高灵敏度弱光成像器作为图像接收器，它具有结构简单、灵敏度高和定量化的特点，在给出细胞荧光图像的同时，可以给出细胞图像任意像元的发光强度值，作为判断细胞细微生理变化的依据
随着灵敏度的进一步提高, 出现了超高灵敏度荧光显微镜, 它是利用第二代像增强器代替了高灵敏度荧光显微镜中的第一代像增强器, 可以获得细胞的光子灵敏显微图像, 并结合图像融合技术, 实现极微弱荧光图像的定位显示, 同时, 采用具有视频速率的图像采集系统, 可用于研究某区域荧光强度随时间变化的动力学过程, 并开始应用于细胞凋亡过程中 Ca2 +浓度变化的研究。
在普通荧光显微镜上配置光子检测系统和计算机处理控制系统就构成了显微荧光分光光度检测系 统,就能够对样品进行原位荧光光谱分析,即利用荧光显微镜获得的荧光图象经过光谱融合处理后得到光谱图像,其中每一点都记录着相应点在不同波长激发下的全部荧光信息,可以方便的获取任意一 点的光谱曲线。
适应现代生物学和医学向分子、细胞水平的定量研究需要,采用先进的光电技术和计算机技术,设计开发了符合实用要求的细胞显微荧光定量分析系统,证明可在利用现有设备基础上通过低成本的技术改造达到国外昂贵、复杂系统的性能,解决了理论、设计和研制工作的关键问题,为研制、生产符合国情的新颖细胞显微荧光定量分析仪器提供了基础.在进一步仪器化技术开发工作中,要在计算机软件功能拓宽,扩大应用使用范围,引入双波长检测以及仪器的商品化设计、制造工艺研究等方面,再做更多细致的技术性工艺性工作。
参考文献：
荧光显微镜技术的基本原理与方法_杨弘远
荧光显微分析技术在植物细胞学研究中的应用_姜淑媛
1、 激光共聚焦扫描显微镜是现代最先进的细胞分析仪器之一，请查阅资料，了解其工作原理和特点。
激光共聚焦扫描显微镜是近代生物医学图像仪器的重要发展之一，他是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如钙离子、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。
1.激光共聚焦扫描显微镜的成像原理及组成
激光共聚焦扫描显微镜的成像原理是由激光发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束致敬较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。只有在物镜的焦平面上发出的荧光才能够到达检测器，其他位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。
ACAS ULTMA312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达0.1微米，扫描面积最大的为10cm*8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应广点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件，可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活，直观地进行形态学观察。
1.定量荧光测量
ACAS 可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体，DNA、RNA、和受体分子量、成分及分布进行定性及定量测定，还可以测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高
灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
2.定量共聚焦图像分析
借助ACAS 激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生化特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。
3.三维重组分析生物结构
ACAS适用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可以从任意角度观察，也可借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果
4.动态荧光测定
钙离子、PH、及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线和二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用多种荧光探针对各种离子作定量分析。可直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中钙离子对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针的同时测定。
5.荧光光漂白恢复——活细胞的动力学参数
荧光光漂白恢复技术借助高强度的脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光消灭，该区域周围的光消灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散速率、恢复速率，并由此揭示细胞结构及相关的机制。
6.胞间通讯研究
动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内钙离子，PH和caMP水平对缝隙连接的调节作用。
7.细胞膜流动性测定
ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动由自由度依赖于荧光分子周围膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜的流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用
结语
激光共聚焦扫描显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图像。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量钙离子，PH值，钠、镁离子等影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光共聚焦扫描显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光共聚焦扫描显微镜是普遍显微镜上质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛应用于荧光定量测定，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力参数分析和胞间通讯研究方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。
激光共聚焦扫描显微成像系统及其信息分析的研究 共聚焦激光扫描显微镜的研制 参考文献：
胡茂海 周一览 南京理工大学 浙江大学
