效应（Brodersen& Voinnet, 2006;Vaucheret, 2006）。RNA沉默的转移性不仅通过级联放大作用使次级siRNA的含量迅速增加，而且还使靶标结合位点发生变化。沉默扩散效应能在植物遭受次级侵染时，赋予其快速启动系统性防御的能力（Fahlgren et al., 2006; Schwach et al., 2005; Yoon et al., 2009; Yoon et al., 2010）。4. RNA沉默抑制子
4.1RNA沉默抑制子的研究进展
RNA沉默是真核生物中普遍存在的，用来抵抗病毒入侵和外来核酸的一种防御机制。针对这一机制，病毒通过编码RNA沉默抑制子（RNA silencing suppressor, RSS）来对抗RNA沉默（Palauqui et al., 1997; Reed et al., 2003; Voinnet, 2001）。
最近的研究表明，植物本身也通过编码内源RNA沉默抑制子（Endogenous suppressor of RNA silencing, ESR）参与RNA沉默的调控（Anandalakshmi et al., 2000）。2000年，Anandalakshmi研究团队在普通烟中分离出与烟草蚀纹病毒（Tobaccoetchviru, TEV）编码的沉默抑制子HC-Pro互作的rgs-CaM蛋白，经鉴定该蛋白能够抑制单链RNA触发的沉默，这是第一个被鉴定的植物内源沉默抑制子（Anandalakshmi et al., 2000）。在随后的研究中，Nakahara等人还发现rgs-CaM能与包括2b在内的自身含有dsRNA结合域的多种病毒抑制子互作，从而减弱它们的抑制作用（Nakahara et al., 2012）。Kazuki等人还发现rgs-CaM能够快速应答伤害的诱导（Tadamura et al., 2012）。在病毒成功侵染之前，rgs-CaM快速高效的表达可以视为是一种抗病毒的病原体相关分子模式。rgs-CaM看似矛盾的双重功能表明，病毒和寄主植物之间存在一个竞争平衡，彼此都折衷妥协以求共存，这也是自然界长期进化选择的结果。
有些病毒编码的抑制子如HC-Pro和 p38，不是简单地去干扰沉默路径中相关基因的表达，而是通过转录因子RAV2上调某些在寄主防御反应中发挥隐性作用的基因（Endres et al., 2010）。在这类基因中，AtFRY1和AtCML38（与rgs-CaM同源）均是内源沉默抑制子（Anandalakshmi et al., 2000; Gy et al., 2007）。病毒抑制子在完成沉默抑制的过程中有可能需要一种或多种内源蛋白的协助或是两者互作实现功能的放大以有效阻止沉默的发生和传播，而这类内源蛋白可能会被赋予内源抑制子的活性参与对RNA沉默的调控。
秀丽隐杆线虫中也相继发现多种内源沉默抑制子，它们通过降解siRNA或mRNA等方式去发挥沉默抑制作用（Kennedy et al., 2004; Souret et al., 2004）。现已在植物和动物中鉴定10余种内源沉默抑制子（表1-1）。它们的序列组成及结构高度多样性，发挥抑制作用的方式也各不相同，这也反映出病毒和寄主互作关系的复杂性。
4.2RNA沉默抑制子的鉴定
自1998年，HC-Pro和2b作为RNA沉默抑制子被鉴定以来（Anandalakshmi et al., 1998; Béclin et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau & Carrington, 1998），经过十几年的研究，现已在不同物种中鉴定了80多种的RNA沉默抑制子。综上文献所述，较为成熟的沉默抑制子鉴定体系主要有以下几种：
（1）农杆菌介导的瞬时表达体系：该鉴定体系具有快速简便的优点，应用最为广泛（Voinnet et al., 2000）。该体系的原理是利用稳定表达GFP的本生烟16c，通过农杆菌介导的瞬时表达表达GFP触发侵染区GFP沉默，如果共表达一个候选抑制子蛋白和GFP时侵染区GFP不发生沉默，该蛋白即被鉴定为RNA沉默抑制子（图1-2）。此体系适用于快速检测大量的候选沉默抑制子蛋白，也可用来研究沉默抑制子的必需结构域及关键氨基酸位点（Kasschau & Carrington, 2001）。
（2）利用病毒载体异源表达候选抑制子蛋白并观察重组病毒致病力的变化：这种方法通常采用改造过的病毒载体如马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）载体等来表达候选抑制子。如果重组病毒使PVX的发病加重，则可以初步确定该蛋白为RNA沉默抑制子。但因PVX本身也编码一个弱沉默抑制子p25，这种方法曾引起了科学界的争议。
（3）功能互补法：该方法的原理是用一个已鉴定的沉默抑制子蛋白替代候选抑制子蛋白。2002年，Yelina等发现大麦条纹花叶病毒（Barely stripe mosaic virus，BSMV）γb蛋白缺失突变体致病力大大减弱，但这个缺失γb蛋白的突变株在转马铃薯A病毒（Potato virus A, PVA）HC-Pro基因的植株内却表现很强的致病力，并且用HC-Pro替换γb的重组病毒有很强的致病力，同时没有检测到病毒siRNA的累积。因此推测γb可能与HC-Pro一样具有抑制RNA沉默的功能（Yelina et al., 2002）。
由于抑制子的表达水平、激发子的形式及抑制能力均存在差异，因此依靠单
一鉴定方法得到的实验结果并不一定准确，需要结合其它方法加以验证。 5.RNA沉默抑制子的作用机制
沉默抑制子可针对沉默通路中的关键成分，在多个步骤抑制RNA沉默。根据已研究的典型RNA沉默抑制子的作用特点，将沉默抑制子的作用方式分为以下几类：
5.1 结合dsRNA或siRNA
dsRNA是诱导RNA沉默发生的关键因子，一些RNA沉默抑制子结合长链dsRNA在沉默发生的起始阶段发挥作用。如兽棚病毒（Flock house virus, FHV）编码的B2包含dsRNA结合结构域，其以二聚体的形式结合不同长度的dsRNA来抑制沉默（Lingel et al., 2005）。还有石柑子潜隐病毒（Pothos latent aureus virus, PoLV）编码的p14蛋白能非特异性地结合dsRNA从而抑制沉默的发生（Mérai et al., 2005; Thomas et al., 2003）。
另一类沉默抑制子能够选择性地结合特定长度的siRNA，比较典型的是番茄丛矮病
毒（Tomato bushy stunt virus, TBSV）编码的p19。对p19蛋白的晶体结构解析显示，p19能形成二聚体选择性结合3′端有2个核苷酸突出的21nt siRNA，但对19nt和23-26nt的siRNA亲和性较低（Vargason et al., 2003）。p19能够阻止siRNA组装到RISC复合体中，但是不能够阻止已装配的RISC复合体对靶mRNA的剪切，这表明p19是通过结合siRNA阻止其装配到RISC复合体中来抑制RNA沉默。
5.2干扰Dicer或AGO的功能
Dicer和AGO是RNA沉默路径中两个极其重要的蛋白。Dicer主要负责将dsRNA剪切为siRNA，对沉默信号的起始有着非常重要的作用。而AGO是构成RISC复合体的重要组分，既可以介导靶mRNA降解，又可以参与翻译抑制或转录水平沉默。已经发现许多RNA沉默抑制子可以通过与Dicer或AGO蛋白互作发挥抑制作用。黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）编码的2b蛋白是最早被发现作用于AGO蛋白的抑制子。研究表明，2b既可与AGO1的PAZ结构域直接作用，抑制AGO1的剪切活性，又可与AGO4互作，干扰基因组DNA的甲基化修饰（Pontes et al., 2006）。芜菁皱叶病毒（Turnip crinkle virus, TCV）
编码的p38蛋白能抑制DCL4的活性阻断RNA沉默途径（Thomas et al., 2003）。同时，p38蛋白也可以以二聚体或多聚体的形式通过自身的GW/WG基序特异性地结合AGO1，从而阻止RISC复合体的形成来抑制RNA沉默（Azevedo et al., 2010）。另外，PVX编码的p25可与多个AGO互作，并通过26S蛋白酶体途径促进AGO1的降解（CHIU et al., 2010）。 5.3 作用于沉默途径中的其它因子
在RNA沉默的路径中，除了Dicer和AGO以外，其他蛋白因子也发挥着非常重要的作用，它们也是抑制子发挥作用的靶标位点。在抗病毒的RNA沉默中主要依赖于次级siRNA的产生，RDR6在这一过程中负责识别病毒dsRNA，产生次级siRNA（Garcia-Ruiz et al., 2010; Wang et al., 2010）。内源沉默抑制子Nbrgs-CaM能够抑制RDR6的表达（图1-3），阻断RDR6识别异常mRNA而触发的沉默（Li et al., 2014）。SGS3可结合5′端突出的dsRNA，与RDR6共同参与次级siRNA的形成，而番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow curl leaf geminivirus, TYLCV）编码的V2蛋白也可以结合带有5′端突出的dsRNA。V2直接作用于SGS3，与其竞争结合dsRNA，进而阻断次级siRNA的形成来抑制沉默（Glick et al., 2008）。DRB4是一个dsRNA结合蛋白，可与DCL4互作，协助DCL4产生21nt siRNA（Nakazawa et al., 2007）。研究表明，在转P6的拟南芥中，P6能与DRB4相互作用，进而抑制DCL4的活性阻止沉默的发生（Haas et al., 2008）。
参考文献
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