RNA沉默研究进
黄旭 15110700027 遗传学
基因沉默（gene silencing）是一种生物体内由于某些原因而使特定基因无法表达的调节机制，也是生物界在进化上高度保守的一种基因表达调控机制。该现象最早在1928年关于烟草环斑病毒的研究中发现，当寄主植物受到病毒的侵染时，就会产生一种针对有亲缘关系病毒的防御能力，避免次级侵染（Anandalakshmi et al., 1998; Baulcombe, 2004）。1990年，Napoli等为了加深花的颜色，将与色素合成有密切关系的查尔酮合成酶（Chalcone synthase, CHS）基因导入到紫花矮牵牛中，出乎意料的是花的颜色不但没有加深，反而变成了白色或紫白相间的。随后对这一现象的研究发现，在转基因植株中并没有新基因表达，而只是与植物本身的色素合成相关基因的表达受到了抑制（Fire et al., 1998; Napoli et al., 1990）。因其是在RNA水平上的，这一现象被称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS），具体表现为启动子能够正常驱动基因的转录，但是在转录水平导致靶标mRNA的降解致使其累积量很低或不能累积，又被称为RNA沉默（RNA silencing）（Kooter et al., 1999）。
1998年，Fire等发现细胞内双链RNA（double-strand RNA, dsRNA）能诱导基因沉默，提出了RNA干扰（RNA interfering, RNAi）的假说（Fire et al., 1998）。2005年，Zamore等认为小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）途径中的关键步骤是许多物种调控内源基因表达所共有的（Zamore & Haley, 2005）。近十几年来，RNA沉默已成为生命科学领域中的研究热点之一，有关RNA沉默发生的过程现在已经基本被阐明（Khvorova et al., 2003; Tomari & Zamore, 2005; Vaucheret et al., 2004）。2006年，美国斯坦福大学医学院的Andrew Z.Fire教授和马萨诸塞大学医学院的CraigC. Mello教授因在RNAi研究领域中的杰出贡献而获得诺贝尔生理学或医学奖。于此同时，关于RNA沉默的应用研究也有了很大的进展。已相继建立了多种植物基因沉默技术，例如microRNA（miRNA）技术、反义RNA技术以及病毒诱导基因沉默技术（virus-induced gene silencing, VIGS）等（Chuang & Meyerowitz, 2000; Chung et al., 2004; Wesley et al., 2001）。 1. RNA沉默的发生过程
关于RNA沉默的作用机制已日渐清晰，dsRNA是触发基因沉默的关键分子
（Fire et al., 1998; Tabara et al., 1998）。
1992年，Lindbo等和Jones等分别提出了RNA阈值模型（RNA threshold model）和异常RNA模型（aberrant RNA model）（Jones et al., 1999; Lindbo & Dougherty, 1992）。这两个模型都着重于研究沉默发生的起始阶段，能在一定程度上解释部分RNA沉默的现象。在随后的对参与RNA沉默的细胞组分的深入研究中，使人们对其可能的作用机制有了更为全面的了解。在众多假说中，Mahmoodur等提出的dsRNA触发模型得到了普遍的认可，整个过程大致分三步
图 1-1 转录后基因沉默机制模式图（Mahmoodur et al., 2008）
第一步：dsRNA的形成。dsRNA是触发RNA沉默发生的关键分子，病毒的单链RNA（single-stranded，ssRNA）依靠自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependent RNA polymerase, RDRP）进行复制，在这个过程中产生的dsRNA能够诱导沉默的发生。另外，转座子在基因组中也可以移动DNA序列产生dsRNA（Nyk?nen et al., 2001）。第二步：siRNA的产生。长链dsRNA在Dicer的剪切下产生的21-24nt的siRNA是RNA沉默发生的直接参与者（Zamore et al., 2000）。2001年，Elbashir等也证明21-23nt的siRNA可引起同源mRNA的降解（Elbashir et al., 2001）。有研究表明，QDE-3、MUT-7分别是链孢菌、线虫的核糖核酸酶类似酶，其作用与Dicer大致相同（Cogoni & Macino, 1999; Ketting et al., 1999）。第三步：靶mRNA的降解和次级siRNA的形成。siRNA被组装到一种
核糖核蛋白
复合体中，即RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）。RISC复合体在ATP的供能下具有解旋酶活性，能使siRNA解旋为单链，然后结合并降解同源靶mRNA，从而抑制其翻译。与此同时，释放出来的siRNA作为一段特殊的引物，在机体RDR的参与下，以靶mRNA为模板合成dsRNA，被Dicer的剪切为次级siRNA。新产生的次级siRNA进入到上述循环中，进一步降解靶mRNA分子，从而产生级联放大效应。在RNA沉默发生的过程中，21-23nt的siRNA能移动10-15个细胞，负责沉默信号的短距离传导，而24-26nt的siRNA很可能参与到干扰信号的长距离传导中。 2.与RNA沉默的相关的小分子RNA
研究表明，RNA沉默的发生常涉及到小分子RNA，形成非常复杂的调控网络。这类小分子RNA根据其生理功能和生化性质大致分为两类：siRNA和miRNA。这两类小分子RNA均属于非编码RNA，长度都为21-26nt。siRNA包含5'磷酸基团和3'羟基基团，且在3'端突出两个核苷酸。siRNA是dsRNA在不同Dicer酶的剪切下产生的，可以分为长短两种形式，长的24-26nt，短的21-23nt（Klahre et al., 2002）。 而miRNA则是内源发夹RNA（hairpin RNA, hpRNA）经Dicer-like 1（DCL1）加工之后产生的一类长度约为18-25nt的小分子RNA，它们多数具有高度保守性、时序性和组织特异性。高等真核生物中能够编码miRNA的基因转录形成初级转录物（primary microRNA, pri-miRNA）（Bartel, 2004）。随后，pri-miRNA在DCL1的作用下形成60-70nthpRNA，称为前体miRNA（precursor miRNA, pre-miRNA）（Gregory et al., 2004; Lee et al., 2003）。这两种小分子RNA在作用机制上有相同之处，都能在多种酶的作用下参与对同源mRNA降解。但两者也有不同之处，siRNA主要参与抗病毒的RNA沉默，而miRNA主要参与对生长发育的调控（Ambros, 2001; Baumberger & Baulcombe, 2005; Bergmann et al., 2000; Pasquinelli & Ruvkun, 2002; Valencia-Sanchez et al., 2006）。 3. 参与RNA沉默的主要细胞组分 3.1. Dicer
Dicer是一种核糖核酸内切酶，属于RNaseIII家族，能够特异性地识别并切割dsRNA（Margis et al., 2006）。Dicer最早是在果蝇中被发现的（Lee et al., 2004），
植物中的同源蛋白被称为Dicer-like（DCL）。拟南芥基因组编码4种DCL，分别作用于不同的沉默途径且成员间存在着功能冗余（Dunoyer et al., 2005; Moissiard et al., 2007; Xie et al., 2004）。DCL1与miRNA的产生密切相关（Kurihara & Watanabe, 2004）；DCL2主要参与转基因。
诱导的RNA沉默，能够把天然的顺式反义转录本切割为siRNA（Mlotshwa et al., 2008）；DCL3剪切产生的siRNA主要参与到染色体的修饰过程（Pikaard, 2006）；DCL4剪切产生的反式作用小干扰RNA（trans-acting siRNA, tasiRNA）在转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）中起主要作用（Liu et al., 2007）。DCL2 和DCL4在抗病毒沉默过程存在功能的冗余，当DCL4失活时DCL2发挥作用（Deleris et al., 2006）。 3.2. AGO
Argonaute（AGO）是RISC复合体的核心组分，在目前已知的所有RNA沉默途径中都有参与。拟南芥中AGO蛋白包含10个家族成员，即AGO1-AGO10。AGO蛋白主要包含两个结构域：PAZ和PIWI。PAZ主要由α螺旋和β折叠组成，高度保守，在RISC复合体中负责与siRNA的结合（Liu et al., 2004）；PIWI与RNaseH结构类似，不同的是，PIWI在最后1个片层和最后1个螺旋之间还有其他序列存在（Parker et al., 2004）。另外，PIWI还存在一个能与Dicer结合的位点，可以通过与Dicer互作装配RISC复合体（Tahbaz et al., 2004）。AGO1能够募集包括siRNA在内的多种小分子RNA形成复合体，在体外具有内切酶活性（Galun, 2005）。AGO2和AGO5能够特异性的结合5′端分别为A和C的病毒RNA（Mi et al., 2008）。AGO4和RDM1在细胞核中共表达，参与调控RNA介导的DNA甲基化（RNA-directed DNA Methylation, RdDM）（Gao et al., 2010）。 3.3. RNA依赖的RNA聚合酶
RNA依赖的RNA聚合酶（RDR）属于RNA依赖性聚合酶家族成员，普遍存在于真核生物和病毒中。RDR按其分子结构可以分为两个大类：RNA病毒RDRP和细胞内RDR，它们在功能上相似，都能以RNA为模板合成RNA（Wassenegger & Krczal, 2006）。现已在拟南芥中分离6种RDR，即RDR1、RDR2、RDR3a、RDR3b、RDR3c和RDR6。
RDR的存在赋予了RNA沉默两个重要特征：沉默信号的转移性和沉默扩散
