该克隆插入片段含有与探针重叠的顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步。该技术通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，从而慢慢靠近目的基因。
②应用：染色体步移技术是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列，即侧翼序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。
(6)exon trapping and its application：
①外显子捕获技术。即通过对基因组片段迅速扫描从而得知外显子的存在的一种技术。
②应用：外显子捕捉技术用了一种特殊的载体，它要求这种载体带有强启动子且在两个外显子之间只有一个内含子，当这个载体转染到细胞后，可转录产生大量的含有两个外显子序列的RNA。如果基因组片段中含有一个外显子，那么它的序列可以在细胞质RNA中被发现，但如果基因组片段中只由内含子中的序列组成，那么剪接就不会发生，且mRNA也不会运输到细胞质中。
(7) 5'-UTR、3'-UTR：5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子。3'-UTR从编
码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。
(8) globin：珠蛋白。具有携带氧能力的蛋白质
(9) Rubisco：1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶。是一种酶(EC 4.1.1.39)，分子量约为53kD，由8个大亚基
和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶。
(10) What’s the function of the Rubisco and why it can be used for animals?
L4
(1) shot-gun approach：鸟枪法。在进行基因克隆的第一步，基因组DNA的片段化时，如果待克隆的给
体材料是双链的基因组DNA，有好几种方法都可以用来制备片段化的DNA群体。其中最简单的一种办法是利用限制酶消化给体基因组DNA。这种消化产物，不经过凝胶电泳分部分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法，叫做鸟枪法(shot-gun approach)。
(2)衔接物：是一种用人工方法合成的DNA短片段，具有一个或数个在其要连接的受体DNA上并不存在的
限制酶识别位点。
(3)末端转移酶：（Terminaltransferase,TdT）是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷
酸结合到DNA分子的3'羟基端。
(4) Saccharomyces cerevisiae：
酿酒酵母，又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，酿酒酵母还是第一个完成基因组测序的真核生物，它在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类，它的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm，繁殖的方法为出芽生殖。
(5) C. elegans：秀丽隐杆线虫，是一种可以独立生存的线虫，长度约1mm，生活在温度恒定的环境中。C.
elegans大部分是雌雄同体个体，其基因组很小且与原核生物相似。它被做为一种模式生物被大量应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学的研究中，尤其在研究细胞分化方面特别有贡献，而且是第一个基因组完全被测序的多细胞生物。
(6)非互补粘性末端DNA分子间的连接方法。
具有非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过专门作用于单链DNA的Sl核酸酶处理变成平末端之后，可以使用T4 DNA连接酶进行有效连接。可以使用附加衔接物的办法来提高平末端间的连接作用的效率。衔接物是一种用人工方法合成的DNA短片段，具有一个或数个在其要连接的受体DNA上并不存在的限制酶识别位点。如果要连接的是具有非互补的粘性末端的载体分子和外源DNA片段，可先用Sl核酸酶除去粘性末端，形成平末端的片段，便可按平末端连接法分别给它们加上相同的一段衔接物。如此带有衔接物的载体分子和外源DNA片段，随后再用只在衔接物中具有的唯一识别位点的限制酶切割，结果就会产生出能够彼此互补的粘性末端。这样就可以按照常规的办法，用T4 DNA连接酶将它们连接起来。此外，应用附加接头或同聚物加尾技术也能够有效地连接DNA分子。
(7) How to prevent the formation of circular molecule for linear vector？
如何阻止线性载体形成环化分子？
阻止经限制酶切割后的线性载体分子自身的再环化作用，可以提高DNA片段的插入效率。目前阻止线性载体形成环化分子通用的方法有三种：第一，用碱性磷酸酶处理由限制酶消化产生的线性载体分子；第二，使用同聚物加尾连接技术；第三，应用柯斯质粒。
(8) gene amplification：
基因扩增。是指带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，导入适当的寄主细 胞进行繁殖，从而获得大量的单一的重组体DNA分子的过程。
(9) transformation：转化。在基因操作中，感受态的大肠杆菌细胞
捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。
(10) How to clone the gene via complementation?
如何通过互补作用克隆基因？（举例）
如果被克隆的DNA片段，同重组体DNA分子的寄主细胞的染色体DNA是同源的，那么使用互补作用进行基因克隆，是一种十分有效的方法。它的一种最简单的方式是，将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，即一组含有大肠杆菌基因组全部DNA序列结构的重组体DNA分子的异源群体，导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞。然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的底物的基本培养基上。因此，只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落，从而得到目的DNA片段克隆。
例如a-互补实验，由a-互补产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在有生色底物X-Gal存在的培养基中产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致无a-互补功能的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称蓝白筛选。
(11) How to produce cDNA library?
如何构建cDNA文库？
cDNA克隆的基本过程是通过一系列的酶催作用，使总poly(A) mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内，如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库。其具体步骤如下：
①分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的部分。一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷酸组成的寡聚核苷酸[oligo(dT)]，能够同惰性物质如纤维素（或琼脂糖）结合。当细胞总 RNA制剂通过已用oligo(dT)处理过的纤维素柱时，mRNA分子的pol(A)尾巴便会同oligo(dT)序列杂交而粘附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子则流出柱子。经过处理，可从纤维素柱子中洗脱下了纯净的mRNA分子。
②合成第一链 cDNA。其中一种方法叫做oligo(dT)引导的cDNA合成法。另外一种叫做随机引物引导的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis）。此法的基本原理是，根据许多可能的序列，合成出6～10个核苷酸长的寡核昔酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在这种情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生。
③将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。可采用自我引导合成法或置换合成。
④将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。重组的方式是先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或者更常用的是将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，尔后再同经适当处理而具有相应末端的载体分子连接。将如此构成的重组体分子导入大肠杆菌寄主细胞进行扩增，于是便得到了所需的cDNA文库。
(12) How to clone gene for genome?
如何克隆基因组DNA？
基因组DNA克隆与cDNA克隆不同，它的出发材料是基因组DNA。由于cDNA分子比较小，可以在质粒载体上克隆。高等真核生物染色体基因组DNA的基因文库，通常是用λ噬菌体或柯斯质粒作载体构建的。 ①应用λ噬菌体载体构建基因组文库。第一步是，从给体生物制备基因组DNA，并用限制酶消化法产生出适于克隆的DNA片段。然后，在体外将这些DNA片段同适当的λ噬菌体连接成重组体分子，并转化到大肠杆菌的受体细胞中去。最后，从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的克隆。
②应用柯斯质粒载体构建基因组文库。为了使真核基因组DNA克隆到柯斯质粒载体上，需用核酸内切限制酶Sau3A局部消化基因组DNA。然后分离收集分子量为35～45kb的片段群体，并同线性化处理的柯斯质粒载体DNA连接重组。经体外包装之后，感染给大肠杆菌寄主细胞。在细胞内，柯斯质粒载体按质粒特性进行复制扩增，形成基因组文库。
L5
1.Plasmid：质粒。是一类在细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA。
λPhage：λ噬菌体。它是一种感染大肠杆菌寄主细胞的温和噬菌体，已成为主要的基因克隆载体，可以携
带较长的外源DNA片段，其最大容量为18-22kb。线性λ噬菌体分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此互补的单链延伸末端，由这段粘性末端结合形成的双链区域叫cos位点。
Cosmid：柯斯质粒。一类人工建造的，含有λ噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载
体，其DNA可以在体外被包装到噬菌体的外壳内。所以柯斯质粒兼具λ噬菌体与质粒载体的特性，具有高容量的克隆能力，可用于克隆大片段的DNA分子，它克隆外源DNA的片段约为35-45kb。
2.举例阐述互补作用基因克隆。（参见L4） 3.利用cDNA克隆某基因(举例)。
cDNA克隆的基本过程是通过一系列的酶催作用，使总poly(A) mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库。例如，具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反转录酶的作用下，可合成出双链cDNA。随后将它与质粒载体构成重组分子，并转化给大肠杆菌寄主细胞进行扩增。应用这种方法能够分离和扩增我们所期望研究的基因或DNA片段。
4.GATC：即同尾酶酶切后产生的粘性末端GACT序列。同尾酶是一组来源不同，识别序列各异，但能够切
割形成相同粘性末端GACT序列的限制性内切酶。例如BamHI、BglI和Sau3A即是一组同尾酶。
5.举例说明基因定位克隆的使用。
