齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
图3-8 重组质粒p1.1-2测序色谱图
Figure 3-8 Chomatography of the sequencing of recombined plasmid p1.1-1
28
齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
讨 论
4.1 菌落PCR鉴定重组
采用菌落PCR鉴定重组质粒，可不必提取基因组DNA，不必酶切，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。
4.2 重组质粒穿梭载体的构建
RNAi技术是一项快速、高效和便于操作的使靶向基因失活的新技术。，据此设计出的siRNA可以使某些特定的基因沉默[33]。实验选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒作为载体。这个载体的特点是含有H1启动子，在此H1启动子的作用是精确的起始和终止转录的过程。将具有茎环结构的shRNA的cDNA序列插入其下游多克隆位点区，通过这样的操作产生的RNA会折叠成shRNA，由于Dicer的作用，生成21bp的siRNA作为介质促发RNAi作用。
在参考了大量文献的基础上，构建、筛选并鉴定靶向mrp1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP穿梭质粒表达载体。并在此基础上做了些调整：为了可以广泛的筛选菌落，采用菌落PCR的实验方法进行初步筛选阳性菌落；利用含Amp抗生素的平板筛选阳性重组子，也起到了大大简化筛选工作的功效[34]。
29
齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
结 论
1、传统的碱裂解法配合使用氯化锂、PEG8000，可以快速、高效、优质的提取质粒DNA。实验中得到的质粒纯度约为1.835。
2、采用双酶切切割载体，可保证插入外源片段的方向，并且可以防止载体的自连，提高重组率。
3、通过菌落PCR初步筛选阳性菌落，减少了繁琐的质粒提取过程及大量的酶切鉴定，大大提高了效率。
4、利用含Amp抗生素的平板筛选阳性重组子，简化了筛选工作。 5、经测序检测结果可知成功构建了重组表达载体。
30
齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
参考文献
[1] van der Krol AR，Mur LA，de Lange P，et a1．Inhibition of flower pigmentation by antisense CHS genes： promoter and imal sequence requirements for the antisense efect[J]．Plant Mol Biol，1990，14(4)：457—466.
[2] Coqoni C, Morelli G, Carattoli A, Macino G. Molecular characterization of upstream regulatory sequences controlling the photoinduced expression of the albino-3 gene of Neurospora crassa.Mol Microbiol, 1994, 13（5）:787-95.
[3] Guo S, Kemphues KJ. par21 , a gene requiredfor establishingpolarityinC. elegans embryos, encodes a putative Ser/ Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell ,1995 ,81:6112620.
[4] 张淑华. 小干扰RNA靶向VEGF基因在体内外抑制乳腺癌细胞增殖的研究 [D]. 青
岛:青岛大学硕士，2007.
[5] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double2stranded RNAin Caenorhabditis elegans. Nature ,1998 ,391:8062811.
[6] 张淑华,葛郁芝. 小RNA——肥厚型心肌病治疗新展望 [J]. 临床心血管病杂志, 2009,
25 (1) :3.
[7] Sharp PA. RNA interference-2001 . Genes Dev. 2001, 15: 485-490.
[8] Sharp PA, Zamore PD. Molecular biology RNA interference [J]. Science. 2000, 287(5462):
2431-2433.
[9] 康洁, 刘福林. RNAi的抗病毒作用及其机制[J]. 现代免疫学, 2004, 24(5): 439-441. [10] 林少微,王雪华,郑高哲等. RNAi的研究进展 [J]. 中国医药导报, 2007, 4 (29) _3 . [11] Hammond SM, Bernstein E, Beach D, et al. An RNA-directed Nuclease Med
iates Post-transcriptional Gene Silencing in Drosopila Cells. Nature. 2000, 404(6775): 293-296.
[12] 朱汝森, 刘新光, 梁念慈. RNAi实现策略的进展[J]. 国外医学临床生物化学与检验
学分册. 2005, 25(3): 214-215.
[13] 黄艳敏,贾欣秒. RNA干扰技术的研究进展 [J]. 河北化工, 2009, 32 (1):213-216 . [14] Wu H, Halt W H, Yang J M. Small interfering RNA-induced suppressionof mdrl（P-glycoprotein）restores sensitivity to muhidrug resistance cancer cells [J] .Cancer Research, 2003, 63（7）:1515-15l9
31