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第3章 结果与分析 ........................................................ 22
3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果 .......................... 22
3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果 ........................... 22 3.1.2 目的片段的回收 .............................................. 23 3.2 重组载体的菌落PCR ............................................... 24 3.3 重组质粒大量提取 .................................................. 25 3.4 重组质粒测序结果 .................................................. 26 讨 论 .................................................................... 29
4.1 菌落PCR鉴定重组 ................................................. 29 4.2 重组质粒穿梭载体的构建 ............................................ 29 结 论 .................................................................... 30 参考文献 ................................................................. 31 致 谢 ................................................................... 34
IV
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第1章 绪 论
1.1 RNAi的研究进展
RNA干扰(RNA interference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。
1.1.1 RNAi的发现过程
1990年，Rich Jorgensan 和他的同事在对矮牵牛花进行实验时，无意中发现一种奇怪的现象。他们尝试把pigment-produing这种由强有力的启动子控制的基因导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果却发现不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。Rich Jorgensan 把这种现象称为共同抑制，因为导入了外源性基因，使得和内源性基因具有相似功能的基因的表达都被抑制了[1]。遗憾的是当时这种现象并未引起Jorgensen 的重视。1994年，Cogoni[2]和Macino采用粗糙脉胞霉进行转基因研究时，发现真菌中也存在类似的现象，他们称之为基因抑制，这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。1995 年 Guo[3] 等在对线虫的实验中发现，正义 RNA 与反义 RNA 一样可以阻断par21 基因的表达，可惜作者同样对这一现象也没有更深入的研究，只做了普通的报道。直到 1998年，关于 RNAi 现象的研究才被人们真正的发现[4]。Fire[5]等将双链 RNA，即正义链和反义链的混合物，注射到线虫的体内，却诱发了比正义链或反义链的单独注射效果更强的基因沉默，要彻底使同源基因的表达沉默，在每一个细胞中，只需要很少的几个分子的双链就可以做到。在接下来进行的实验中还证实[6]，将双链RNA注入线虫体内后 ，不但阻断了线虫体内所有同源基因的表达，同时还沉默了其第 1 代子代的同源基因，他们从此把这种现象命名为 RNAi。随后，RNAi 现象又陆续在果蝇、锥形虫、真菌、涡虫、植物及斑马鱼等真核生物的研究中被发现[7]。这种情况揭示了RNAi现象可能出现于生命进化的早期阶段，在RNAi机制发现之前，不同生物中的RNAi现象有
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着不同的描述：真菌中称为―镇压‖作用，在植物中被称为转录后基因沉默和基因协同抑制 [8]。
1.1.2 RNAi的分子作用机制
RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。[9]。其中，RNAi的特异效应作用机制是在多个不同的水平上实现的，包括翻译水平、转录水平、转录后水平等。其中，转录后水平RNA干扰的研究最为深入，应用也最为广泛。[10] 1.1.2.1 特异性效应
转录后水平的RNA干扰的发生机制是在对果蝇、线虫等生物体进行科学研究从而进一步推导得出来的。随着科学技术的发展和RNAi研究的深入，人们对RNAi的作用机制的了解也越来越多，通过生化和遗传学研究，现在普遍认为RNAi可能的作用机制主要包括两个阶段：第一步：起始阶段，即内源或外源dsRNA经特定的RNase III 家族的双链特异的核糖核酸酶(Dicer) 以ATP 依赖的方式将长的dsRNA 切割成21～23 nt的小干扰RNA；第二步，效应阶段，即siRNA与RNA诱导沉默复合物RISC结合共同降解靶mRNA[11]。除此之外还有某些研究认为RNAi的作用机制还存在着第三阶段——循环放大阶段。这是RNAi的自身循环放大机制，其机制主要是指在效应阶段，RISC活化后与mRNA结合，mRNA被内切核酸酶切割成大小在l2～23nt不等的小片段，这些片段可以特异性地阻碍表达靶基因。同时，释放出来一种可以作为特殊引物的siRNA，从而以靶mRNA为模板在RdRP的作用下，合成新的dsRNA。这种dsRNA可以降解成新的siRNA，在这个循环中表现出放大效应 [10]。
抑制相应mRNA的翻译可阻碍相应的蛋白质表达，这就是翻译水平的RNA干扰机制[12]，其中stRNA起到了非常的重要作用。
转录水平上的RNA机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，从而加强同源DNA的甲基化，以阻碍目的基因转录，使表达关闭，从而强化基因沉默。有文献谈到组蛋白H3及相应DNA区域可被dsRNA诱导甲基化。一旦启动子区域出现甲基化，那么转录将被阻断，如编码区出现甲基化，则可以进行转录，但在转录后水平上沉默。 1.1.2.2 非特异效应
研究表明，长度大于30nt的长双链RNA转染至哺乳动物体内，dsRNA会激活双链RNA所依赖的蛋白激酶途径[13]，从而导致EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，诱发全面的细胞基因沉默。
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1.1.3 RNAi的特点
RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。任何单个碱基的改变即导致RNAi失效，RNAi能特异性降解mRNA，针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活。除此之外，RNAi还具有共抑制性、种属时效性和dsRNA的长度限制性的特点。
1.1.4 siRNA简介
RNA干扰作用是通过siRNA（small interfering RNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。RNaseIII核酶家族的Dicer是RNA干扰中一个非常重要的酶。它可以结合到dsRNA上，并剪切其成为21～23nt且3'端突出的小分子RNA片断，形成siRNA。[14]
1.1.5 siRNA的设计原则
RNAi 作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大， 2001年，Elbashir S M等[15]应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA 设计方法：1) 从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs 的蛋白结合位点，；2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之间[16]； 4) 要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是，Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi，提高效率，理性设计siRNA有效序列成为siRNA 研究的重要方向。目前, 影响siRNA功能的因素包括siRNA序列的结构特点，靶mRNA的空间结构RISC与siRNA的相互作用，以及siRNA与mRNA错配等[17]。
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