基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定
序列的覆盖度占整个的95%，与一种假单胞菌（Pseudomonas）菌株的16SrRNA的核苷酸序列（403bp）相似性达到97%。该菌的基因序列号为EU681009.1(Pseudomonas sp.W15Feb26 16S ribosomal RNA gene Pseudomonas sp.W15Feb26 16S ribosomal RNA gene,EU681009.1)
根据上面的步骤我们把剩下的微生物鉴定出来的结果列成表格的形式如表3.
表3.微生物鉴定结果汇总
英文名称 属别 query coverage max ident Cellvibrio sp. 纤维弧菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Rheinheimera sp. 棍着色菌属 Tepidiphilus sp. 硫杆状菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Bacillus pumilus 短小芽孢杆菌 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Shewanella baltica 波罗的海希瓦氏菌
Shewanella sp. 希瓦氏菌 Serratia marcescens
粘质沙雷氏菌
Shewanella sp. 希瓦氏菌 Pectobacterium 果胶杆菌属 Shewanella baltica 波罗的海希瓦氏菌
Aeromonas sp.
气单胞菌 Serratia proteamaculans
变形斑沙雷氏菌
Serratia marcescens 粘质沙雷氏菌菌株
Shewanella sp. 希瓦氏菌 Aeromonas sp. 气单胞菌 Shewanella baltica 波罗的海希瓦氏菌
Aeromonas sp. 气单胞菌 Shewanella sp. 希瓦氏菌 Shewanella sp. 希瓦氏菌 Pseudomonas 假单胞菌 Shewanella sp. 希瓦氏菌 Aeromona daceae 气单胞菌科细菌
Aeromonas sp. 气单胞菌 Pseudomonas sp. 假单胞菌 Pseudomonas sp. 假单胞菌 Aeromonas salmonicida 杀鲑气单胞菌 Aeromonadaceae bacterium
气单胞菌科细菌
Shewanella sp.
希瓦氏菌
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60% 96% 92% 91% 92% 95% 61% 92% 24% 77% 91% 98% 43% 99% 45% 85% 98% 99% 98% 94% 97% 97% 98% 96% 98% 96% 92% 93% 94% 98% 88% 91% 98% 93% 98% 98% 81% 90% 99% 96% 56% 96% 97% 90% 75% 87% 99% 99% 97% 89% 99% 99% 86% 94% 91% 98% 94% 98% 96% 98% 98% 98% 82% 96% 93% 99% 91% 98% 22% 90% 98%
98%
基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定
Shewanella sp.
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas sp. Pseudomonas sp.
Pseudomonas fluorescens
Rahnella aquatilis Rahnella aquatilis
希瓦氏菌 荧光假单胞菌株
假单胞菌 假单胞菌属 荧光假单胞菌 水生拉恩氏菌 水生拉恩氏菌
86% 91% 96% 83% 98% 95% 97%
81% 95% 96% 90% 97% 99% 97%
属别的形态及生理生化特征的分析：从列表中测算出微生物的平均覆盖度是85%，平均最大相似度是94%，这些数据表明鉴定微生物结果是比较可靠的。
6.2讨论
6.2.1对实验结果的分析
(1)本实验样品是30°00′-31°00′E,122°10′-124°00′E组成的长江口杭州湾附近海域内采集的。采集地点位于潮间带以外。由于采集的地点远离陆地,从而确保分离到的微生物是真正的海洋微生物，从而排除陆地微生物的污染。
(2)从鉴定出的微生物的生理生化分析的结果来看，这些细菌大致有以下特性：运动性、异养或化能异养、寡营养性、嗜盐性，嗜低温性，抵抗力强。从呼吸作用方式来看，有好氧型、厌氧型和兼性厌氧型的细菌，它们对氧的要求并不高。绝大多数海洋细菌都具有运动能力，这和微生物所生成的环境有关系，只有运动才能获得足够的营养。异养细菌和浮游植物有很大的关系，所以初级生产是影响长江口邻近海域浮游异养细菌分布的重要因素。由于海水中营养物质比较稀薄，大多数细菌都是寡营养细菌。海水中有机碳的平均水平相当低，寡营养细菌能够利用低浓度的有机碳，因此，寡营养细菌是海洋浮游生物的主要成员，在生物地球化学循环中起重要作用。对寡营养细菌生态学的研究，能为有效控制海洋生物圈的物质循环和能量流动提供可靠依据。研究发现氯气、甲烷和一氧化碳这些气体在任何环境中都微量存在，极有可能被寡营养细菌用来作为能量储备，以对付其生存环境可能出现的营养物质缺乏。嗜盐性，嗜低温性都是由于海洋独特的环境所决定的。在这个独特的环境中，生物必须具有强的抵抗力，例如芽孢杆菌产生孢子来度过不良环境。 6.2.2．用16SrDNA微生物鉴定的方法的优点
传统的微生物分类是依赖纯培养分离方法，通过表型特征和细胞形态学的观察，对其生理生化反应和细胞组成成分结构进行比较分析来实现分类鉴定的。许多研究结果表明，这种方法有很大的缺陷。（1）在自然环境中有许多的菌种用传统的方法无法培养出来，同时纯培养分离忽略了气候变化和生物相互作用的影响，丢失了大量的微生物资源。（2）在培养基上不可避免的会造成菌株的富集或衰减，人为改变了原始菌群的微生态构成，对研究结果造成
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了较大的偏差。（3）根据形态特征、理化特征、菌体某些化学成分对菌株进行分类鉴定菌株的确很有用，至今这些特性的应用十分有限。根据这些缺点，在加上于海洋独特的环境, 包括高盐、高压、低营养、低温等, 造就了海洋微生物有别于陆地微生物的诸多特异性而导致对它们种类区分的困难, 有碍于海洋微生物研究和开发的深入, 因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对海洋微生物进行分析, 使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到海洋微生物的分类地位, 为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。
随着科学的发展，以16SrDNA为基础的现代分子生物学技术体高了解析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，可以实现快速，微量，准确简便的对微生物进行分类鉴定。操作简便还可有效地避免实验数据丢失;通过从基因水平探索微生物群落的丰度、均匀度、分析菌种的变异情况等,可将微生物多样性的研究提高到遗传多样性水平上,为全面认识微生物多样性在生态系统中的原始构成、筛选出未知菌种提供了行之有效的技术手段。
虽然可以用DNAG+CmoL％含量测定和DNA／DNA杂交、随机扩增DNA多态性图谱(RAPD)分析和限制性片段长度多态性分析(RFLP分析)、DNA探针分析等其他的分子生物学技术来进行鉴定微生物，但16SrRNA测序技术表现的更高效，更准确、更简便，有很强的特异性。随着基因组学的迅猛发展, 细菌16SrRNA间隔区序列数据库不断扩大,运用16SrRNA序列分析技术对微生物进行分类鉴定,确定微生物在进化中的位置,已成为微生物分类学中最重要的方法。 6.2.3．存在的问题
（1）在实验过程中，我们很难提取到DNA，用了很多方法才得以成功。失败的原因有很多，比如我们采集到的物品没有及时操作，而且我们生活的环境和海洋微生物生活的环境不相同，可能导致海洋微生物不适合环境而死亡，因为死亡的微生物中的RNA很容易降解，这就使得微生物在采集到实验这一段很长的时间内我们很少采集到总的DNA；还有就是没有很好的控制细菌污染问题。环境中的细菌无处不在，很有可能是样品中进入了杂菌，使得海洋中的微生物不能正常生长，所以在试验中如何控制细菌污染是一个关键问题。通过各个环节的严格无菌操作,选择恰当的扩增循环次数,DNA提取、扩增和产物分析的隔离措施,以及使用一次性吸头等,可提高鉴定的正确性和可靠性。
（2）以16SrDNA/RNA为基础的分子生物学技术正日益成为微生物种群分析的重要手段,但在应用这些技术时必须清楚地认识到它们存在的局限性和偏差,例如核酸提取的效率和PCR中的问题等。下面以PCR中出现的问题来说明。模板DNA是PCR体系中最重要的基本成分，它可能受到蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染，所以要选用纯化的DNA做模板，增加增加模板分子的浓度,除去可能抑制PCR反应的杂质，如SDS
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会严重抑制TaqDNA聚合酶的活性。还有就是引物的设计，两个引物中G+C碱基对的百分比(G+C%)应尽量相似,避免引物自身形成发夹结构等二级结构,以减少“引物二聚体”的形成，所以在对分析结果进行解释和推论时需要充分考虑这些因素。
（3）一般PCR通常仅对特定病原体进行检测,而在微生物未明时,需用多种不同引物对多种微生物分别进行PCR扩增,而现实中根本不可能用PCR逐一探测每种可能的菌株,使得PCR技术在检测中的应用受到了限制。核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。其中16SrRNA既具有保守区，又具有可变区，故16SrRNA既可以作为细菌分类的标志,又可作为临鉴定的靶分子，但是由于16SrRNA基因内所含的多态性位点较少一般只能鉴定到属，即使与SSCP或RFLP分析相结合,也只能将细菌鉴定至种。一些可能含有相同或相似序列的菌种或亚种,往往需测序才能鉴定,这就限制了其应用于快速鉴定微生物的广泛性。
为解决以上问题,国内外利用16SrRNA设计的检测方案主要是:将两条引物设计在保守区成为通用引物,而在中间的特异区中选择序列做探针进行进一步鉴定。由于16SrRNA序列的保守性和存在的普遍性,以及核酸序列本身的稳定性,序列分析的重现性极高,基于当今分析技术的改进,应用16SrRNA作为分子指标,可以实现快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。分子分类正是在从研究的目的过渡到研究的手段。随着分子分类的理论和方法的日趋成熟,其已逐步成为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力的工具。 6.2.4．对未来的展望
PCR扩增rRNA基因技术作为一种新的菌种鉴定技术,其研究还不够成熟,需要不断改进完善操作方法和实验条件,以便为菌种分类和鉴别诊断提供依据。现在16SrRNA基因PCR扩增与计算机分析相结合已被证明是鉴定病原菌快速、有效、准确的方法,再加上生物芯片的不断开发，相信在未来实践的发展中，以16SrRNA为基础的现代分子生物学技术能更快、更准确的对微生物进行分类鉴定，微生物检测将迈上更高的台阶，这样对我们进一步研究长江口的微生物,加强微生物多样性的研究,丰富我们对海洋微生物多样性的认识,利用这些特殊的微生物资源奠定基础。
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