基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定
缓冲液不要超过三角瓶的50%。
C．在三角瓶上盖上锡箔纸,用微波炉或在沸水上加热至琼脂糖溶解,然后使溶液冷却至60℃,此时胶浓度为1%,再加入2.5ul溴化乙锭(EB)溶液(用蒸馏水配制),充分混匀(注意EB有毒,强诱变剂,有致癌作用,操作时务必戴上手套,小心操作)。
D．用加样枪吸取少量溶液封住档板边缘。在距离底板0.5–1.0mm处放置梳子。 E．将剩余的溶液倒入塑料盘中。凝胶厚度为3-5mm,用枪头将溶液中的气泡排掉。 F．凝胶完全凝固(约需30-40min)后,小心拔去梳子,将塑料盘及凝胶一起放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm的1×TBE,准备点样。
G.DNA样品和6×DNA Loading buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)以5：1比值混合后，用微量枪慢慢将混合物加至样品槽中，最边上的孔加Marber2-3ul对照。 I.盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动，采用电压为80～100V。
J.溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。 K.跑完电泳后在紫外光下观察结果：
溴化乙锭是荧光染料，该物质含有一个特殊的碱基，会导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于结合了染色剂的DNA和其它物质所发出的荧光属于不同的发光段，因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
5.3 PCR扩增检测
（1）PCR引物:根据细菌特有的高度保守序列16srDNA，设计合成了一对引物：
27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 1492r 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′
(2)PCR反应体系（50ul）：PCR反应的基本成分包括:模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液
其中模板DNA（提出的细菌DNA）8ul；其他的基本成分如下表1所示：
表1.部分反应体系
反应成分 Reaction Components ddH2O PCR Buffer DNTPs 引物1 引物2 Taq酶
10*PCR Buffer 25mmol/l 1.0umol/l 1.0umol/l 2.5U/ul 储备液浓度 Stock Solution Concentration
终浓度 Final Concentration
工作液配制 Working Solution Preparation
-
1*PCR Buffer 2mmol/l 0.3umol/l 0.3umol/l 0.25U/ul 第9页共 17页
-
29ul 5ul 4ul 1.5ul 1.5ul 0.5ul
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终体积
- -
50ul
说明：10×Buffer是提取缓冲液；dNTP是四种脱氧核苷三磷酸；Taq酶是DNA聚合酶
（3）PCR扩增条件:PCR扩增是通过变性(denaturation)、退火(an-nealing)和延伸(extension)三个步骤反复循环来实现的。因此,确定正确的PCR反应程序参数是PCR成功的保证。
热循环参数设置为：预变性95C5min；95C变性1min；53C退火1min；72C延伸1.5min，进行了30个循环；72C延伸10min；4C保存。具体反应程序如表2.
表2.反应程序
Step1 预变性：95℃ 5min Step2 变性：95℃ Step3 退火：53℃ Step4 延伸：72℃ Step6 延伸：72℃ Step7 保温：4℃ Step8 结束
1min 1min 1.5min 10min 1-12h
o
o
o
o
o
o
Step5 2-4步骤，30个循环
PCR技术十分灵敏，少数几个模板分子就可以检查出来。它的括增效率非常高，通常可以括增10倍。其扩增产量可以按下列公式计算：
6
y =(1+x)
n
y=产量
x=扩增效率 n=循环次数
PCR反应在EPPENDORF PCR仪上进行。PCR产物经脱盐纯化后,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，点样量为3μl。
5.4割胶纯化PCR产物
A.从琼脂糖凝胶中切下DNA条带（尽量切除多余的部分）,然后把条带放入离心管中，称取重量。
B.向胶块中加入4倍体积溶胶液PN，然后在50℃的水浴中放置10min。期间不断上下翻转离心管，使胶块完全溶解。溶解完全后放置在常温下2-3min。
C.把上述溶液放入到吸附柱中，3，000rpm离心30s，重复一次，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
D.向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，然后重复一次步骤3的操作。
E.向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，13，000rpm离心30s，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，13，000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，
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彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。（影响回收率和DNA质量）
F.将吸附柱放入一干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加25mlddH20，室温放置2min。13，000rpm离心1min收集DNA溶液。
G.可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复6。即把其室温放置2min。13，000rpm离心1min，收集DNA溶液。
H.纯化后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.5 PCR产物的电泳检测
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,是大多数实验室常用的方法。尽管琼脂糖凝胶的分辨能力较低,但分离范围广。 具体操作步骤如下:
A．洗净玻璃板或塑料盘并干燥备用。调节电泳槽底脚螺丝使其水平,在塑料盘两侧放置挡板。 B．根据扩增片段大小所需浓度,准确称量琼脂糖于三角瓶中,加入50ml1×TAE电泳缓冲液。缓冲液不要超过三角瓶的50%。
C．在三角瓶上盖上锡箔纸,用微波炉或在沸水上加热至琼脂糖溶解,然后使溶液冷却至60℃,此时胶浓度为1%,再加入2.5ul溴化乙锭(EB)溶液(用蒸馏水配制),充分混匀 D．用加样枪吸取少量溶液封住档板边缘。在距离底板0.5–1.0mm处放置梳子。 E．将剩余的溶液倒入塑料盘中。凝胶厚度为3-5mm,用枪头将溶液中的气泡排掉。 F．凝胶完全凝固(约需30-40min)后,小心拔去梳子,将塑料盘及凝胶一起放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm的1×TAE,准备点样。
G.DNA样品和6×DNA Loading buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)以5：1比值混合后，用微量枪慢慢将混合物加至样品槽中，最边上的孔加Marber2-3ul对照。 H．盖上电泳槽并通电,电压为80～100V,使DNA向阳极移动。
I．待溴酚蓝和二甲苯青在凝胶中迁移出适当的距离,切断电源,小心取出凝胶在紫外灯或紫外透射仪下检查凝胶并摄影。
5.6．16SrDNA的测序和分析
将以上PCR扩增纯化产物直接送至测序公司,用ABI3730全自动测序仪进行序列测定。然后把获得的序列与GenBank数据库中已存在的细菌16SrDNA序列进行相似性比较。
6.结果与讨论
6.1结果
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6.1.1.DNA的提取和PCR扩增
将从样品中提取的总DNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳,在20kb左右出现条带(如图2A),表明已获得较为完整的微生物的全部基因组的DNA。提取出的基因组DNA经过用16sRNA引物PCR后,均获得了特异扩增片段,扩增片断约1,400bp左右,此片断为16SrDNA基因的全序列扩增(如图2B)。图1显示了一个样品的总DNA和16SrDNA基因的扩增产物。
A
图2(A和B).细菌基因组DNA和16SrDNA的PCR产物
B
6.1.2 16SrDNA序列测定与种类鉴定
对纯化后PCR扩增产物直接进行测序，我们获得如下序列结果。 对一种单菌落部分测序结果（713bp）
GGGGACGTTATCGGATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGAGGTTATGGCAGTTATTAGTGGGCTACACACGTGCGGTAAAGATCTGGTGTTGGGCTGC
将该序列与GenBank数据库中已存在的细菌16SrRNA序列进行相似性比较，我们发现：该
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