基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定
相对于DNA的提取较为复杂,一般研究多采用提取细胞总DNA,但也可根据情况选择提取rRNA。由于rRNA在死亡的细胞中很快降解,提取rRNA通过反转录钓取16SrDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞(Ku rabachew,1998)。 （2）16SrRNA基因片段的获得
过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到K噬菌体中建立DNA库,进一步通过16SrRNA通用探针进行杂交,筛选含有16SrDNA序列的克隆(鸟枪法)。由于PCR技术的产生和发展,现在一般采用16SrRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列,或通过反转录PCR获得CrDNA序列后再进行分析。采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16SrRNA序列,而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现PCR所固有的缺点,尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增,可能出现嵌合产物(Chimericproduct)和扩增偏嗜性现象,影响结果的分析。
（3）通过16SrRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定
16SrRNA基因片段的分析方法主要包括以下3种:一是将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序,与16SrRNA数据库中的序列进行比较,确定其在进化树中的位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类,该方法获得的信息最全面,但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。二是通过16SrRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此外探针也可以直接与样品进行原位杂交检测,通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度,而且能够分析它们的空间分布。该方法简单快速,主要应用于快速检测,但可能出现假阳性或假阴性结果。三是对PCR产物进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms,RFLP)分析,通过观察酶切电泳图谱、数值分析,确定微生物基因的核糖体型,再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。
4.3微生物多样性与DNA指纹技术
环境样品中的微生物DNA提取物通常是不同微生物的DNA混合物,经过PCR后,其产物是序列等长但不同源DNA片段的混合物。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。如果可以将这些序列等长但不同源DNA片段分离开,则可对样品中微生物群落的组成进行初步的分析。经过多年的研究,现在已经有多种DNA指纹技术,又称为多态性分析,可以用于上述DNA片段的分离,它们包括如变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Elec-trophoresis,DGGE),温度梯度凝胶电(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE),单链构象多态性分析(Single Strain Conformation Polymorphism,SSCP),限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length
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Polymorphism,RFLP),末端限制性片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T2RFLP)等。
DGGE的原理是:在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度,DNA双链一旦解链,其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降;因此,将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳,序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置,染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带,一般可视为具有相同的DNA序列。
尽管DGGE凝胶上的条带可以在回收后用于测序,以便进行更详尽的微生物分类分析,但研究者一般仅利用DGGE等技术进行微生物群落的初步分析,而用建立细菌16SrDNA文库的方法进行更为深入的分析。
4.4.DNA测序及微生物分类鉴定
对微生物16SrDNA进行测序时最好进行全长测序,尤其是所测序列将要用于探针设计和新物种确定时。另外,采用正反向引物对所测序列进行重复验证可以确保序列的准确性。但由于目前测序费用还比较高昂,因此许多研究者也采用测16SrDNA部分序列的方法进行微生物多样性分析和平行样品比较。研究表明,400～600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计,但这样短的序列通常不能用于新物种鉴定和探针设计。
有了微生物16SrDNA序列,不论是全长还是部分,都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类,但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogeneticanalysis)。
系统发育分析,就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子(如16SrDNA、ATP酶基因)的序列同源性,计算不同物种之间的遗传距离,然后采用聚类分析等方法,将微生物进行分类,并将结果用系统发育树(phylogenetictree)表示。计算菌属、菌种之间的遗传距离可以采用不同方法,如Jukes-Cantor方法。在计算遗传距离之后,构建进化树时有许多种方法,其中以NeighborJoin法最为常用。在进行系统发育树分析时常用到的一些软件包括MEGA2.1和ARB。
5.材料与方法
5.1材料
5.1.1样品的采集
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调查区域范围为长江口冲淡水与外海水团交汇的锋面区域，有沿岸向东外海海域共设置两条断面，断面1范围为30°00′N， 122°30′-124°00′E间设置10个调查站位；断面2范围为31°00′N， 122°10′-124°00′E间设置12个调查站位；另外在30°20′ N， 124°00′E；30°40′ N，124°00′E设置2个站点，共计设置调查站位24个。样品采集时间为2008年秋季。样品暂放于4℃冰箱中，带回实验室。带回实验室后立即准备后续的海洋悬浮物的微生物培养工作。具体采样地点如图1。
121 121.5 122 122.5 123 123.5 124 124.5 125 31.5 31 30.5 30 29.5 1 图1 样品采样的地点
说明：我们这次的调查范围是在靠近长江口的杭州湾附近，是在1这个点位采集的样品带回来进行研究的。
5.1.2其它设备和仪器
5.1.2.1主要试剂:
(1)配制100ml的TE溶液:10Mm Tris-HCl；1mM EDTA(pH=8)；1ml Tris母液;0.2mlEDTA母液定溶到100ml,高压灭菌4℃保存备用。
(2)抽提液I 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(盛与棕色瓶) (3)抽提液II 氯仿:异戊醇=24:1(盛与棕色瓶) (4)70%乙醇 (5)100%异丙醇 （6）10%SDS溶液 （7）蛋白酶K3 （8）Nacl溶液 （9）CTAB/ NaCl溶液 （10）异丙醇 5.1.2.2实验仪器
海尔冰箱 BCD-196F青岛海尔股份有限公司 ；
FEB-78型双向磁力加热搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；
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DHG-9053A型 电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；
不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 YXQ-SG46-280S 上海博迅实业有限公司医疗设备厂； SW-CJ-2F型双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司； ZF-6型三用紫外线分析仪 上海嘉鹏科技有限公司； BIO-RAD电泳槽 PowerPac Basic 041BR 38252；
SHZ-A水浴恒温振荡器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂； DK-8B型 电热恒温水槽 上海华连医疗器械有限公司； EPPENDORF PCR仪 5341 0605679； EPPENDORF 离心机3417R 5407 0022202；
格兰仕微波炉 P70D17TL-D5 佛山市顺德区微炉有限公司； 电子天平BS124S 40960483 北京赛多利斯仪器系统有限公司；
5.2 提取DNA的步骤
我们采集到的微生物没有进行培养，直接进行微生物鉴定实验。本次实验是采用传统的方法即酚、氯仿法。传统法是目前最常用最可靠的DNA提取方法,所需费用低,所提取的DNA可满足临床各种检测需要，但操作繁琐,耗时长,DNA损失量大,产率低,且有污染和毒性作用，传统法适用于初学者或经费有限的实验室。具体步骤如下：
（1） 把溶液放进离心机中离心，然后移去上清液，得到沉淀物质。 （2）加入567ulTE溶液重悬
（3）加入10%SDS 30μl和20mg/ml蛋白酶K3μl,于37℃温育1h （4）加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,4℃12000g/min离心5min。
（5）将上清液转入另1个离心管中加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,4℃12000g/min离心
5min
（6）提取上清置于另一管中,加入0.6体积异丙醇,轻柔混合,4℃12000g/min离心5min （7）弃上清,加入70%乙醇洗涤1min,离心,弃上清
（8）将沉淀的DNA溶于100μl的无菌去离子水中,-20℃保存备用
细菌离心（12000g/min,4min）,10%的SDS去破壁,蛋白酶K3溶解蛋白,CTAB/NaCl溶液去多糖,氯仿/异戊醇和酚/氯仿/异戊醇抽提,异丙醇沉淀DNA,最后以70 %乙醇溶解。
5.3．用电泳检测DNA
A．洗净玻璃板或塑料盘并干燥备用，调节电泳槽底脚螺丝使其水平,在塑料盘两侧放置挡板。 B．根据扩增片段大小所需浓度,准确称量琼脂糖于三角瓶中,加入50ml 1×TbE电泳缓冲液。
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