农业生物实用技术试题
1.请阐述细胞全能性与植物组织培养的关系。（10分）
答：植物细胞全能性（totipotency）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础 植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 2.原生质体杂种细胞的筛选方法。（10分）
答：杂种细胞的筛选方法有：①细胞系互补的选择方法，包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补等；②利用物理特异性差异的选择方法：这是利用两个原生质体物理特异性差异的一种选择，包括原生质体的大小、颜色、浮密度等的不同来选择；③利用生长特异性差异的选择方法。 3. 简单说明DNA重组技术中的蓝白斑筛选原理。（10分）
答：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 4. 请介绍3种植物目的基因的克隆方法，并说出其优缺点。（10分）
答：目前，用于植物基因克隆的常见方法有:（ps：下面随意挑三个方法就行啦） 1)图位克隆技术:建立在遗传分析和基囚足位的基础上，该技术对于基因组较大的作物，例如小麦基因的克隆难度较大; 2)转座子标签法:利用转座子插入突变使某一基因失活，进而用转座子特异基因片段做探针分离出突变的目的基因，该方法需要筛选并鉴定突变体，工作量较大: 3)差异显示技术:直接鉴定和克隆差异表达墓因，但存在假阳性率高和有些差异表达带不易扩增等问题； 4)酵母单杂交技术:在植物中应用较多的是转录因子基因的克隆，该方法针对性强，但假阳性较高； 5 ) cDNA文库筛选技术是一种经典的克隆基因的方法，但不易得到完整的基因全长，特别是基因的5’端。 5. 如何提高转基因的表达水平。（10分）
答：实现外源基因高效表达的种种途径包括：启动子的选择和改造;目的基因的改造;构建含有核基质结合区的表达载体;建立位点特异重组体系；利用细胞器定位信号和采用叶绿体进行转化等。 1.启动子是决定外源基因转录效率的关键因素,选择合适的启动子对于增强外源基因的表达量至关重要。 2.对于微生物或动物来源的基因由于表达机制的不同,在高等植物中往往表达效果不理想,这时如果在不改变氨基酸序列的前提下通过人工改造或重新合成,使之适于在植物体内表达,就可以大大提高有效蛋白的表达量。 3.目前,采用基因枪或农杆菌法导入的外源基因在宿主染色体上的整合大多是随机发生的,如外源基因整合在转录活跃的常染色质可能得到较好的表达。但高等植物的绝大多数细胞在特定阶段有90%以上的基因在转录上是不活跃的,插入到这部分染色质区的转基因其表达活性则会大大下降,甚至出现沉默。这时如果我们能建立位点特异的重组系统则可克服这一难题。 外源基因在植物组织细胞中表达时,其表达产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解,造成外源蛋白积累量的减少。因此,采取措施保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功的重要一环。以植物抗虫基因工程为例,增加外源抗虫物质在植物细胞内的稳定性可有效提高转基因植物的抗虫效果。 4.叶绿体基因拷贝数大,为实现外源基因的超量表达提供了前提;可以定点整合方式导入外源基因从而消除位置效应和转基因沉默;具原核表达方式,可直接表达来自于原核生物的基因,且能以多顺反子的形式表达多个基因。这些都使叶绿体转化系统极具提高转基因表达的潜能。 6. 论述分子标记辅助选择育种对传统育种的贡献。（10分）
答：传统的育种主要依赖于植株的表现型选择。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。分子标记辅助选择育种,指的是经典遗传学和现代分子生物学，在分子遗传学理论指导下,将现代生物技术手段整合与经典遗传育种方法中,综合表现型和基因型筛选,培育优良新品种。 1.分子标记辅助育种技术针对质量性状的选择，常规杂交育种通过对其表现型常年多次重复的观察是可以获得其纯合植株的 但周期一般要七八年甚至是十多年。在常规育种的基础上借助分子技术的辅助手段可以将质量性状准确地定位，大大地降低了回交的次数，也缩减了所需要的年限。 2.借助分子标记辅助手段是直接对基因型进行选择。不但精准，而且效率高，植物大多数的农艺性状都是由多个基因联合调控的，所以单纯的常规育种在针对数量性状的选择上已经达到了瓶颈。 3.分子标记辅助育种不存在安全隐患。因为在整个育种过程当中完全不需要引入外源基因，与转基因育种有本质的区别。这项技术极大地发挥了种群内部遗传多态性的优势，是将种群内部优良性状整合的一个过程。 4.分子标记辅助育种是直接在水平上选择差异，是遗传变异的直接反映它能够根据植物体的各个时期进行选择，不受环境及表达的限制，数量多，多态性高并且遗传稳定。 7. 如何创建一个实用的植物生物反应器? 请举例加以说明。（10分）
答：植物生物反应器是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、
