正式实验设计：
AGS MOCK AGSKD三种细胞各种4个上室，种后24，48,72，96小时每组细胞各处理一个室，
要准备的实验用品：
1 Transwell板：注意使用时保持无菌，因为可能不是12个一起用，比如用完3个，那3
个洞就要用无菌水洗干净，不要残留培养液，盖好盖子，然后封口膜封口，放在干净的地方，不要让它污染了
2 细胞：实验前一天换成无FBS培养基饥饿1天
3 Matrigel：用之前一天，在烧杯里放冰，把放Matrigel的ep管用封口膜封好，从-20度取出
放在冰里，再把烧杯放到4度，24小时，让它慢慢溶解，一定要慢慢升温
4 下层培养液：10%到20?S的培养液，每个well准备2ml左右，每次每个well用500ul 5 上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2% BSA，然后0.22um滤嘴
过滤备用。 6 稀释Matricgel用的培养基：无血清培养基
7 细胞培养板：24孔板，TRANSWELL板有配24孔板，但是自己要准备多一个24孔板，用
来做固定和染色的，可以不灭菌，但一定要干净，干燥的
8 棉签：病房的棉签就可以了，多拿一些，可以不灭菌，但是做好选棉花团比较大的 9 10 11 12 13
1000ul，200ul和10ul枪和枪头，灭菌的
细胞计数板：干净干燥的，要记得还有上面那个盖板哦 胰酶：平时用的就行可 15ml离心管：无菌的
染料：就啊品给的就可以了，但是要问清楚要怎么染：如染之前要不要尔马林固定啊，要染多长时间，染完后要不要洗，要用什么洗，洗多少次，每次多长时间 福尔马林
载玻片：新的，干净没有灰尘的
倒置显微镜：要可以拍照的，公用实验室那台我们用来看荧光的 纸和笔：数细胞后记录的
14 15 16 17
第一天：
1 准备好Transwell板，下层培养液，上层培养液，稀释Matricgel用的培养基，棉签，1000ul，
200ul和10ul枪和枪头，细胞计数板，胰酶，15ml离心管，染料，福尔马林，载玻片， 2 细胞换液，换成无血清培养基
3 在烧杯里放冰，把放Matrigel的ep管用封口膜封好，从-20度取出放在冰里，再把烧杯放到
4度，24小时，让它慢慢溶解，一定要慢慢升温 4 把Transwell板放到-20度，板不要拆封 第二天：
1 拿一盒碎冰，把融化后的gel和transwell板放在冰上 2如果师兄给的胶比较多，准备几个1.5ml的ep管，分装200ul每管，分装后留一管马上用，其他放回-20度保存
3从4度取出无血清培养基按照体积比1:2（gel：培养基）稀释（稀释多少视多少例定，要多预算一点，但不要浪费太多），混匀，但注意千万不要产生气泡，轻轻吹匀就好了 4混完后放回冰上备用
5取出TRANSWELL板，拆开
6往上室加稀释后的GEL，每孔50ul，注意加的时候要均匀铺平，不能有气泡，不能挫破下面的微孔膜（枪头轻轻接触上室微孔膜的中间，接触而已，不要压到，慢慢的从中间加胶，加完后马上盖上板盖，十字形水平摇晃板，注意是马上，而且是水平放在桌上摇，是十字形的摇，就是先左右晃，再前后晃，不能划圆圈的晃，晃每个方向6到10次后，立马把板放到37度培养箱放半小时到50分钟，说明书上说半小时，建议40分钟）
7用这半小时的时间，把细胞消化下来，计数，用无血清的培养液调整浓度（细胞悬液的总体积是100ul每孔，这100ul里要有多少个细胞，问问师兄一孔要种多少，多数是2.5*104） 8 时间到了后往每个上室加100ul的调好浓度的细胞悬液
9 左手拿镊子提起上室，放到旁边的空的孔里，右手用枪在下室加500ul有FBS的培养液，轻轻把上室放回下室里（先把上室底部边边碰到下室培养液，然后再轻轻放下去），盖上盖子，从板底看看上下室之间有没气泡，如有，把上室提起，重新放（一定要保证没气泡） 10放培养箱培养，稀释后没用完的gel丢掉 第三天
1， 在超净台中取出上室，放到另一个24孔板中，标记号（一定要标记好，很容易搞乱的），
其余的盖好transwell板盖继续培养
2， 之后的步骤都可以在外面进行：用枪吸弃去上室的培养基（这时爬过去的细胞其实在微
孔滤膜朝下室的那个面（就是朝下的那个面，还是在微孔滤膜上，不会跑到下室的，所以千万注意千万注意所有操作都不要碰到微孔滤膜朝下室的那个面）） 3， 在另外一个24孔板孔中加入600ul福尔马林
4， 把上室移到福尔马林洞中（轻轻的，不要刮到细胞），在上室加入福尔马林150ul注意标
记，静置15min
5， 把上室的福尔马林吸干净，把上室倒置在24孔板盖子上，在通风厨中自然风干上室的
下表面（没有gel的那一面），大概30到60min， 6， 在另外一个24孔板孔中加入600ul台分蓝，静置1-2h 7， 在另外一个24孔板孔中加入600ul双蒸水，静置2min 8， 重复步骤7，4到5次（动作要轻柔，）
9， 用棉签把朝上的微孔滤膜面上的胶擦去，要擦干净点（孔比较小，吧棉签与膜面垂直，
以棉签竹杆方向为轴心自传，多换几根棉签，多擦几次就干净了，但不要太用力，不要把膜挫破），爬过去的细胞其实在微孔滤膜朝下室的那个面（就是朝下的那个面，还是在微孔滤膜上，不会跑到下室的，所以千万注意千万注意所有操作都不要碰到微孔滤膜朝下室的那个面） 10， 把上室正放在干净的玻片上（有细胞的面贴玻璃，所以放好后不能再移动上室了），
注意标记 11， 拿到倒置显微镜下看，拍照（找均匀的具代表性的拍） 12， 计数（问问师兄计数有什么窍门）（选6-8个视野计数，或者有些人取16个视野，
这样可以将所以细胞数完）
第四天重复第三天 第五天重复第三天 第六天重复第三天