[选取日期] 第四节 产生杂交瘤的实验方法 本章节中的相关具体步骤请参照英文版说明书，以英文说明书为准！ 下面只是一种推荐的方法，每个研究者应根据不同的细胞密度、融合培养基和融合前和
融合后的不同处理进行实验，并参考相关文献。Ohnishi 等(BTX 书目#218)和Ruzin(BTX 书目#183)成功描述了哺乳细胞的融合方案 4.1 材料 4.1.1细胞 4.1.2融合液 4.1.3融合促进剂 4.1.4仪器及其他材料
1 含10%胎牛血清和2mM/Lglutamine的RPMI1640或DMEM 2 Trypsin blue 3 无菌96微孔板 4 无菌
5 带10×和40×物镜的显微镜
6 可选择：2 个冰槽，一个用于试剂 7
8 放置BTX仪器的水平桌或实验台 9 台式离心机 10 无菌圆锥试管 11 可用的高压灭菌锅
4.2融合用小鼠细胞的预处理 4.3融合程序
最优融合参数的建立可能花费一些时间，并且对每种新的骨髓癌/淋巴细胞对都必须进行实验。融合通常在室温下进行，在融合过程中细胞悬浮液也可以放置冰上。此外，也可以在实际的操作过程中，使融合槽放置在冰槽上。融合前必须浓缩细胞，并且用非电解质溶液洗涤。
4.3.1使用标准的0.3M甘露醇（MANNITOL）的融合
骨髓癌细胞和淋巴细胞以1：4的比率混合，混合液1000rpm离心6分钟得到细胞沉淀，弃去上清液，加入无菌0.3M甘露醇（pH 7-7.3）。 细胞用无菌0.3M甘露醇洗涤2次，重新悬浮细胞使密度为2×106/ml备用。细胞在0.3M甘露醇只能保留2小时。
因此，在实验中，准备数个细胞沉淀可能是必需的。 4.3.2使用葡萄糖（GLUCOSE）的融合
也可选择其他的非电解质缓冲液如0.3M葡萄糖（pH 7-7.3）作为标准的0.3M甘露醇的替代，这种情况只需用糖类代替甘露醇，除非细胞可以在葡萄糖中保存4小时。 4.3.3融合促进剂（ELECTIVE）
4.4标准0.3M甘露醇、葡萄糖和相关糖类的融合后程序
1．融合后，在无菌条件下用移液管小心的把细胞悬浮液从融合槽转移到无菌试管。加10（500）ml 含10%胎牛血清和2mM/Lglutamine的RPMI1640或DMEM，静置15分钟。 2．500rpm离心5分钟，弃去上清液。小心的用培养基重新悬浮细胞，把细胞转移到96微孔板，使每孔有2×105个细胞（0.2 ml/孔）。检查所有的孔，确定有足够的培养基。 3．37℃ 5% CO2中孵育过夜
4．第二天取出一半的培养基，并加入HAT培养基。在第4、7、10天，再取出一半的培养基，并加HAT培养基。也可以给细胞补充饲养层或其他的生长因子。
5．每天都检查HAT培养基的筛选情况。一旦观察到克隆形成，就开始在膨大的第一时期提
[选取日期] 供HAT培养基。 4.5提高融合产物的产量的程序 按以上方法准备好用于融合的细胞后，下面的程序有助于优化融合参数。这一点对于没
有过去实验数据的融合的细胞系很重要。 1.用Microslide 确定仪器参数
2.设置AC Voltage (1)和DC Voltage(6)为零
3. 设置AC Pulse Length (2)和DC Pulse Length (5)零 4.在电极间隙中加入细胞悬液 5.增加AC Voltage为10V 6.按一下手动按钮（12），观察30秒。如果细胞没有移动，每次10 V逐渐增加交流电压（AC
Voltage）直到看到细胞移动。
7.如果看到加热或蒸干现象，就改变细胞悬浮液。
8.若改变细胞悬液，关闭排列信号。第二次按一下手动按钮（12）（90秒限制）。只要红色
的指示灯在亮着，信号就在作用中。
9. AC电压和脉冲时间要一直试验到在10-20秒内细胞形成二聚体的比率相当高。记录设置
条件。
10.设置AC脉冲时间在几分钟内都可观察到排列的值
11.设置融合后AC脉冲时间（3）直到9秒，使细胞在电融合后保持成串。
12.根据细胞的生活力优化系统参数。使用最早得到的基本参数设置和用修改的参数设置作
数个实验组
每个实验组的细胞在含10%胎牛血清、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和2mM/Lglutamine的RPMI1640或DMEM中培养4天。每天都用trypan blue exclusion 检测部分培养细胞的活力。选择4天后细胞活力最高的那组参数设置。 13.研究细胞活力的系统参数应按以下进行：
每次按20%的大小改变排列电压（Alignment Voltage）和脉冲时间。电压高要求时间短。 14.按20%逐步改变DC电压和脉冲时间。
15.试验融合后AC脉冲时间时细胞在融合后仍在一起。
4.6植物原生质体的电融合程序
以下的方案仅作为研究人员用植物原生质体进行遗传工程研究的一个指导。 4.6.1基本程序
1.按常规程序分离得到新鲜的原生质体（注意：如果已发生细胞壁再生，融合不会成功）。 2.小心的用移液管加入非电解质融合液
3.弃去上清液，细胞重悬于非电解质融合液，根据细胞大小调节细胞密度为1.5-6×105个
/ml
4.进行电融合。
4.6.2融合液
一般地，非电解质融合液与融合前的溶液的渗透压、pH和组成最相近时，得到的细胞生活
力最高。
1.可使用非电解质的糖如甘露醇、葡萄糖、山梨醇等。
2低盐浓度如CaCl2(140M)或.Hepes 600M为最优的选择，而且在一定时间内，对细胞并没
有害。
3.对每一类型的原生质体都应该研究其最适pH。 pH在7.0-7.5之间，融合最为成功。 4.渗透压应该与分离原生质体的溶液相同。 5.再钙化的原生质体已经成为融合到一起。
4.6.3仪器设置
典型的融合产率在使用protease时为20%，不使用时为7%；PEG处理的融合率一般为1%。 1.增加1个或2个脉冲似乎并不增加融合产量（频率），对原生质体却有损伤。
[选取日期] 2.用于Microslide的典型设置 时间 排列（成串） 35V 25秒 电穿孔 260V 40微秒 产量 总融合率8.6% 异核率2.6%
4.7.1细胞不排列
其余部分及Protocol请参见英文说明书。
[选取日期] 第五节 服务与保修
获取服务：
1. 保修期内的服务：
? 请置电服务维修部门，并将所发现的问题以文本的方式传真到维修部门； ? 依照维修部门的建议，进行调节和观察； ? 如果问题仍未解决，请按照维修部门的通知，将仪器装箱回运到厂家维修部门进行
专业维修。
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2. 保修期外的服务：
? 请置电服务维修部门，并将所发现的问题以文本的方式传真到维修部门； ? 依照维修部门的建议，进行调节和观察； ? 如果问题解决，将没有费用发生。
? 如果问题仍未解决，请按照维修部门的通知，将仪器装箱回运到厂家维修部门进
行专业维修；
? 此时发生的费用，将至少包含运费，维修硬件所产生的元件费用。
