被破坏，加入的SDS与蛋白结合后使得蛋白带有很强的负电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，最终蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小和凝胶分子孔径排阻效应。
对于待检蛋白活性有较高要求的实验中，一般选用Native-PAGE，因为非变性胶在分离蛋白后对蛋白的活性并没有明显的影响，例如EMSA。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时，要用低pH凝胶系统，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。分离酸性蛋白时候，要利用高pH（8.8）凝胶系统，蛋白会带负电荷向阳极移动，SDS -PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，由浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶）组成，当电泳开始后，电泳开始时缓冲液中的氯离子泳动最快,甘氨酸根离子最慢，因此在中间形成低电导区，使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一个狭窄的区带。在进入分离胶后蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动，从而达到分离蛋白的目的。
蛋白分子量不同，所适用生物SDS-PAGE浓度也会对应不同，下表是聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）和对应的蛋白质分离范围（kD）
聚丙烯酰胺凝胶浓度（%） 6 8 10 12 15 配制的凝胶质量对电泳条带的清晰度以及背景有着密切的影响，灌胶前玻璃板一定要洗干净并且用吸水纸擦干；灌胶时不能有气泡；凝胶要彻底才能点样电泳。另外制胶的药品丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在溶解后有毒，因此在制胶过程中一定要小心，注意安全。现在为方便科研工作者，已经有商业化的SDS-PAGE凝胶试剂盒，例如福因德科技（Frdbio）的SDS-PAGE凝胶试剂盒（Frdbio,Cat No.WBR0401）。 ⑶ 电泳
有效分离范围（kD） 50～150 30～90 20～80 12～60 10～40 当样品处在浓缩胶中时电压不宜过高，可将电压调在80V，在电泳大概30min左右，蛋白进入分离胶中，此时可稍微调高电压至120V。电泳过程中由于系统会产热，为得到较好的结果电压不宜过高，但是为节约时间也不能太低，以上是经过实验总结出的较好的电压选择。
为方便观察电泳效果和转膜效果以及判断蛋白分子量大小，最好使用彩色预染蛋白分子量标准（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。蛋白迁移不仅与蛋白自身性质以及PAGE凝胶有关，与电泳液也有一定的关系。电泳液的离子强度，pH等都会影响蛋白的迁移。电泳液可以选择使用福因德科技（Frdbio）生产的SDS-PAGE电泳液（Frdbio,Cat No.WBR0301）。 ⒋ 转膜
将凝胶分离的蛋白从凝胶转移到膜上，目前方法有很多，比如溶移印相法、毛细管转移法、热对流转移法、真空印迹转移法、电转移法等，电转移法由于其快速性及高效性一直备受科研工作者的青睐。转膜的原理与电泳相同，蛋白与SDS结合形成复合体带负电，在正负电场作用下，蛋白从凝胶中转印到膜上。由于膜对蛋白的吸附作用很强，同时由于甲醇的固定作用，所以转移到膜上的蛋白也不会轻易穿透膜“跑出去”，但是对于小分子量的蛋白质还是很容易透过膜的孔径“穿透”出去。所以对于小分子量的蛋白质的转印，转印时间不宜太长。转膜仪的红色代表正极，黑色代表负极，组装时先把湿润的海绵和滤纸依次铺在负极上，再铺上凝胶，随后是膜，接着是滤纸和海绵，形成“三明治”结构（见图2）。注意在铺凝胶和膜的时候一定要注意不能有气泡，尽量用玻璃棒除掉所有气泡。
图2.湿转转膜“三明治”结构
半干转的原理与湿转是一样的，是将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷。在电转仪上铺3层湿润的滤纸，再将膜铺在先铺滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些转移缓冲液到膜上；小心的将凝胶覆在胶上，并做上记号；再在凝胶上铺3层滤纸，注意的是此过程中要保证所有的夹层都是湿润的，半干转膜的夹层示意图如下（图2）。
图2. 半干转膜的夹层示意图
电转移法转膜有可分为湿转和半干转：湿转是一种比较传统的方法，一般使用4℃预冷的转膜缓冲液，并且在4℃条件下进行。湿转电流一般选择在200～400mA，时间为30～90min，也可以15～20mA转膜过夜。片段>50kD的可以选用350mA，小片段的可以用250mA，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定。半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽，因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法比较快。但是，半干转移法中滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路；另外半干转过程中会大量产热但是不好降温，容易将膜烘干；且半干转的效果不如湿转的好，因此还是推荐大家使用湿转的方式。
转膜的效率不仅跟蛋白在特定条件下与膜的结合能力也有关，另外还取决于凝胶的成分、凝胶与膜的接触是否彻底、转膜的时间，蛋白大小、蛋白组成以及电泳液。WB实验中常用的膜有PVDF和NC膜，PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固；PVDF膜使用是需要甲醇预处理的，用目的是活化膜上的正电基团，使其更容
易与带负电的蛋白结合。而NC膜的使用也很简便，不需要预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了。不过NC膜比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途；而PVDF膜具有较高的机械强度，是印迹法中的理想固相支持物材料。
转膜结束后可以用丽春红染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）或者氨基黑10B或印度墨水检测转膜效果，丽春红染色液对膜进行染色不会干扰后续对膜的处理；也可以考染转膜后的PAGE凝胶，检查蛋白是否有残留。 ⒌ 封闭
从凝胶上转印的蛋白不能把膜表面全部占据，因此需要封闭膜上剩余的位点防止抗体非特异性吸附，这就是封闭。最常用的封闭物质是一些非相关蛋白，常见的有BSA、脱脂奶粉、各种动物血清、酪蛋白；封闭缓冲液的对后续蛋白检测的灵敏度、背景、信号强弱都有很大的影响。不同的抗原/抗体会适应不同的封闭缓冲液，所以对于检测效果不怎么理想的蛋白需要开展预实验对其封闭缓冲液配方进行优化。福因德科技（Frdbio）所用封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST(24.22g Tris、87.66g NaCl,加盐酸调pH8.0，0.05%的Tween-20)。
⒍ 洗涤
同其他免疫检测技术一样，WB每一步的试剂孵育之后都要有一步洗涤，洗去游离的未结合的试剂、抗体，洗涤不充分会造成背景高，产生噪音信号，洗涤过度又会导致灵敏度降低，因此对于洗涤液的配方及洗涤时间的控制都需要优化。通常用的洗涤液是含有Tris的TBS或含有磷酸盐的PBS缓冲液，为降低非特异性结合，一般会在洗涤液中加入终浓度0.05%的Tween-20。需要注意的是WB中使用的有些试剂如NP-40、Tween-20容易滋生微生物及真菌，而这些污染会对结果产生很大的影响，因此在实验过程中所用到的试剂都要新鲜配制，过滤除菌，4℃存放，一定要保证所用到的试剂都是无菌高纯度的。福因德科技使用的洗涤液是TBST(0.05% Tween-20)。 ⒍ 一抗孵育
WB主要是由一抗特异性识别膜上的目的蛋白或抗原决定簇，一抗的选择主要依据于待检抗原，需要注意的是并不是所有的一抗都适合于Western检测的使用。一抗的稀释度通常需要预实验摸索条件，可以根据说明书上建议的
