黄曲霉素B1对原发性肝癌的作用
班级： 作者： 一、研究依据
原发性肝癌(PHC)是位居世界第五位的最常见恶性肿瘤，它的发生率几乎就等于其死亡率。其相关危险因素至今仍不是完全清楚。国内外早年均有文献报道了PHC与乙型肝炎病毒(HBV)之间的因果关系，并且从分子生物学角度阐述了它们两者之间的发生机制。因而，HBV导致PHC已经得到了国内外学者的一致肯定。近年来丙型肝炎病毒(HCV)与PHC之间的关系也引起了国内外学者的关注，并且也有相当多的文献报道了HCV能引起PHC。除了两种肝炎病毒可以引起PHC外，有学者研究发现，重度饮酒也会导致PHC，尤其是对已有HBV感染的病人，重度饮酒是导致其发 生PHC的一个重要的危险因素。同时，流行病学还证实，PHC有家族聚集现象，提示PHC可能具有遗传学上的特点。除了上述肝脏疾病的病因外，环境致病因素在．PHC的发生发展中也起着不可或缺的作用。早年就有报道黄曲霉毒素B1(AFBl)可以诱发肝癌。不仅如此，有研究表明糖尿病病人也较容易发生PHC。在基因水平上有学者发现凋亡抑制 基因Survivin可以促进PHC的形成。
二、实验原理 1、黄曲霉素来源
黄曲霉毒素(AF)是黄曲霉菌、寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物，其中以黄曲霉毒索B1(AFB1)的毒性和致癌性最强，AFB1结构如下：被国际癌症研究机构划定为I类致癌物。AFBl广泛存在于污染的食品中，以热带和亚热带地区食品污染为严重。尤其以花生、花生油、玉米以及谷类的污染最为严重。在广西扶绥一个肝癌高发村，76％的花生样品、66．7％的烹饪花生油及23．3％的大米样品中均检测到AFB1。骆建祥等研究表
明，正规生产厂家定型包装花生油AF检测合格率明显高于个体作坊散装花生油。湿热的气候及不当包装和贮存是食物霉变及污染AFB1的主要原因，成为人暴露于AFBl的主要来源。
2、黄曲霉素B1代谢过程
AFB1进人人体后，经体内细胞色素氧化酶代谢转化为AFM1、AFP1、AFQ1和黄曲霉毒素醇等，前三者无活性经尿液排出体外，黄曲霉毒素醇可被代谢活化为最终致癌物，即AFB1-8，
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9-环氧化物(AFBO)，AFBO可与DNA鸟嘌呤结合形成AFB1一DNA加合物，随尿液排出体外；AFBO还可与血清白蛋白结合形成 AFB1-白蛋白（AFB1-alb)加合物而残留于血液中，其主要形式为AFB1一赖氨酸加合物(AFB1-lysine)。
3、黄曲霉素B1致癌机制
AFB1在进入人体后是经肝脏内 CYP450 酶系统作用活化为AFB1-8，9-环氧化物(AFBO)，该物质能与DNA和 RNA 等分子特异位点结合形成加合物，改变了DNA和 RNA 部分特有的结构，引起DNA化学损伤。还有研究报道AFB1及其代谢产物在肝癌发生和演进过程中引起了癌基因（如ras、c-fos）及抑癌基因（如P53、P16）表达的改变。黄曲霉毒素B1肝细胞癌的p53基因249位点突变有关。
4、AFB1-DNA加合物
AFB1-DNA可反映致癌物到达靶器官的效应剂量。AFB1暴露剂量与AFB1-DNA加合物存在强剂量效应关系，测定AFB1-DNA加合物可反映AFB1新近暴露水平及评价发生肝癌的相对危险度，但由于靶组织标本的不易取性限制了该指标的应用。
5、 AFB1-alb加合物
AFB1-alb在体内半衰期长，可反映累积及多重的暴露水平，检测AFB1-alb可作为AFB1暴露的生物标志物及评价肝癌危险性的重要指标。此外，AFB1-alb与AFB1-DNA存在高度相关性，长半衰期和血清标本易采集性使其在肝癌危险性和预防措施评价方面更具优势，可用于高危人群的筛选及化学预防研究中药物疗效的指标。
三、实验目的
本次实验主要研究黄曲霉素B1促进肝癌细胞的主要途径，已经影响黄曲霉素B1致癌的因素（主要测定AFB1-DNA加合物含量）
四、器材和药品
手术刀、注射器、生理盐水0.9%NaCl(aq)、二甲基亚砜（DMSO）、黄曲霉素B1、显微镜、石蜡、HE试剂、。基因组DNA提取试剂盒、Taq PCR MasterMix、PCR仪、免疫化学法相关试剂
五、实验对象
健康幼年大鼠（鼠龄3个月以内、体重200g） 分成5组每组6只
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六、步骤与方法
1.将清醒的30只精神状态良好的大鼠称重、编号，随机分成5组（分别为空白对照组、实验1组、2组、3组、4组）
2、分别给5组大鼠每天腹腔注射生理盐水、二甲基亚砜（DMSO）溶解0.015μg AFB1、DMSO溶解0.030μg AFB1、DMSO溶解0.060μg AFB1、DMSO溶解0.120μg AFB1，连续给药两个月，其他条件保持相同。
3、两个月后，取各组大鼠肝组织HE染色制片，用目镜微网测量变异肝细胞灶的面积和数目，并计算其数密度（单位面积肝组织中的变异数，单位体积肝细胞中的变异数）和体积密度（单位体积肝组织中的变异体积所占百分比），所得数据经统计学处理。
4、用免疫组化染色法测定各组中AFB1-DNA加合物的含量，用PCR检测p53第7外显子249密码子突变情况，p53蛋白表达强度评估采用Fbmowitz等的方法进行。
5、应用SPSS 13.0统计学分析软件，对所得数据进行统计学处理。率的比较用x2检验或Fisher精确概率法检验，检验水准a=0.05。
七、预期结果
1、切片中可见嗜酸结节数目增多，体积增大，部分结节可见嗜酸细胞向嗜酸细胞移行，最后在嗜酸性细胞结节的背景上出现HCC。
2、显微镜下观察，在良好的肝细胞核结构及清晰的背景上细胞核内出现紫黑色点状颗粒者为阳性，肝细胞核内未出现紫黑色点状颗粒则为阴性信号。
3、HCC组织的p53第249位点发生突变，突变主要见于 AGG—AGT或AGG—AGC两种形式。
4、p53蛋白阳性着色均定位在细胞核内，阳性着色细胞大多呈成片或弥漫分布。 5、变异肝细胞灶的面积和数目与腹腔注射黄曲霉素B1的量相关。
参考文献：
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卷第10期
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