哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ·病理生理学教研室
结 果
1.培养THP-1单核细胞并将其诱导为巨噬细胞，见图3
A B
图3 A THP-1单核细胞 B 巨噬细胞 （200X）
2. Transwell方法测定细胞上清液对单核细胞趋化作用，见图4
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图4 A Transwell实验模式图 B 用光学显微镜观察募集的台盼蓝染色后的单核细胞，并计数 C 细胞迁移数 （***：P<0.05;#：P>0.05）
从募集的单核细胞数量来看，声动力治疗组明显高于对照组，P<0.05；加入ATPase并进行声动力治疗组与声动力治疗组相比显著降低，对照组与ATPase组无统计学差异。
3．荧光素酶法测定上清及细胞内ATP含量，见图5
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图5 A ATP浓度与荧光强度标准曲线 B 各组ATP浓度(**:P<0.05;#:P>0.05) 声动力治疗后的ATP浓度明显高于对照组，约为其3倍；加入zVAD-fmk并进行声动力治疗组较声动力组显著降低；对照组与zVAD-fmk无统计学差异；SDT-zVAD组与对照组无统计学差异。
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讨论
动脉粥样硬化目前已经成为了全球范围内，人类健康的严重威胁[20,21]。巨噬细胞介导的炎症反应是导致易损斑块破裂的主要因素[22]，因此在动脉粥样硬化进展中对巨噬细胞积极性干预，对于预防急性心血管事件的发生具有非常重要的临床意义。
有研究认为，在斑块早期，因单核吞噬系统对凋亡巨噬细胞清除能力正常，不会出现继发性的炎症反应和坏死；而随着病变的进展，单核吞噬系统对凋亡坏死物的吞噬清除功能发生障碍[23]，导致斑块内炎症反应加剧，脂质坏死核心扩大，诱发斑块破裂、血栓形成，引发急性心血管事件。在这个过程中，凋亡细胞释放的一系列信号，包括“find-me”、“keep-out” 、“don’t-eat-me”和“come-get-me”信号等，能够调节单核性吞噬细胞的趋化活性和吞噬功能。目前有研究表明，凋亡细胞释放的核苷酸可以作为一种“find-me”信号参与对单核性吞噬细胞的募集[13]。
为了验证SDT治疗巨噬细胞后对单核细胞趋化的效果以及凋亡细胞释放的核苷酸作为“find-me”信号的趋化功能，我们进行了一系列实验。首先，我们采用transwell 趋化性实验证明声动力治疗后的凋亡巨噬细胞能够趋化单核性吞噬细胞，并且初步验证核苷酸能够作为一种“find-me”信号（从实验室现有药品及可行性出发，我们初步选定ATP作为验证对象）。取SDT后6小时细胞上清、对照组细胞上清、ATPase组及SDT-ATPase组，分别加入transwell板下层， 并在transwell板的小室内加入密度为106/ml的单核细胞，继续在胞培养箱内培养1 h后，对下层细胞进行台盼蓝染色，用显微镜拍照后统计下层细胞数。SDT组较对照组单核细胞数显著增加。此实验结果证实声动力治疗后的凋亡巨噬细胞能够趋化单核细胞的聚集。而SDT-ATPase组较对照组显著下降说明ATP可能作为一种“find-me”信号在凋亡巨噬细胞趋化单核细胞的过程中起到一定的作用。
为进一步验证ATP为凋亡细胞释放的一种“find-me”信号，我们使用luminometer测定声动力治疗后ATP浓度。取SDT后20min、对照组、zVAD-fmk组及SDT-zVAd 组细胞上清及细胞裂解液，分别加入配置好的ATP检测工作液当中，反应10s后使用luminometer分别检测细胞上清液及胞内ATP含量。SDT组明显高于对照组，而SDT-zVAd组较SDT组显著降低。本实验证明声动力治疗后的凋亡巨噬细胞促进ATP的释放，从而趋化单核细胞的聚集；而且ATP的释放与caspase途径依赖的凋亡有关。
综上所述，本实验证明了声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞，从而为声动力疗法治疗动脉粥样硬化的机制进行了有益的探索，对声动
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