聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子β半乳糖苷酶、透酶生成。
当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。
3CAP的正性调节
分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。
由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。 4对调节机制的解释
大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。
倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。 在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。 四、真核基因表达调控
（ 一）真核基因组结构特点 1真核基因组结构庞大
哺乳类动物基因组DNA长达3×109个bp。 2单顺反子
真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。
3重复序列
在原核、真核DNA中都有重复出现的核苷酸序列，但在真核更普遍。根据重复频率可将重复序列区分为高度重复序列（106次)、中度重复序列（103～104)及单拷贝序列。单拷贝序列在整个基因组中只出现一次或很少的几次。 4基因不连续性
真核结构基因两侧存在不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部尚有一些不为蛋白质所编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称为外显子，因此真核基因是不连续的。 （二）真核基因表达调控特点 1RNA聚合酶
真核RNA聚合酶有三种，即RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ，分别负责三种RNA转录。TATA盒结合蛋白为三种聚合酶所共有。
2活性染色体结构变化 （1）对核酸酶敏感。 （2）DNA拓扑结构变化。 天然状态的双链DNA以负性超螺旋的构象存在。当基因活化时，RNA聚合酶前方的转录区DNA拓扑结构为正性超螺旋，后面的DNA则为负超螺旋，正性超螺旋不仅阻碍核小体结构形成，而且促进组蛋白 H2A·H2B二聚体的释放，有利转录。（3）DNA碱基修饰变化。 在真核DNA有约5％的胞嘧啶被甲基化为5甲基胞嘧啶，甲基化范围与基因表达程度是反比关系。处于转录活化状态的基因CpG序列一般是低甲基化的。
（4）组蛋白变化。 ①H1样组蛋白减少。②H2A·H2B二聚体不稳定性增加。③组蛋白修饰：最常见的修饰有乙酰化、泛素化，修饰后使核小体结构变得不稳定。④H3组蛋白巯基暴露。 3正性调节占主导
提高了蛋白-DNA相互作用的指导性，经济有效。 4转录与翻译间隔进行
真核细胞有细胞核及胞浆等区间分布，转录与翻译在不同亚细胞结构中进行。 5转录后修饰、加工
（三）真核基因转录激活调节 1顺式作用元件
顺式作用元件是特异转录因子的结合位点，按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。 （1）启动子。
真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件含7－20bp的DNA序列。启动子包括至少一个转录起始点，以及一个以上的功能组件。在这些功能组件中最具典型意义的就是TATA盒，TATA盒通常位于转录起始点上游-25至30bp，控制转录起始的准确性及频率。典型的启动子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（或）GC盒组成，这类启动于通常具有一个转录起始点及
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较高的转录活性。然而，还有很多启动子并不含TATA盒，这类启动子分为两类：一类为富含GC的启动子，最初发现于一类管家基因，这类启动于包括一个或数个分离的转录起始点；另一类启动子既不含TATA盒，也没有GC富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，但多数转录活性很低或根本没有转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。
（2）增强子。所谓强子就是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。 （3）沉默子。某些基因含有负性调节元件——沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
2转录调节因子
（1）转录调节因子分类。转录因子，分为两类：①基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组因子，为所有mRNA转录起动共有②特异转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。
（2）转录调节因子结构。所有转录因子至少包括两个结构域：DNA结合域和转录激活域；此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。①DNA结合域通常由60－100个氨基酸残基组成。最常见的DNA结合域结构形式是锌指结构和碱性α螺旋。类似的碱性DNA结合域多见于碱性亮氨酸拉链和碱性螺旋-环-螺旋。②转录激活域——由30-100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域又有酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。③介导二聚化的结构域——二聚化作用与亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构有关。 3mRMA转录激活及其调节
真核RNA聚合酶Ⅱ不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFⅡD组成成分TBP识别TATA盒或启动元件，并有TFⅡA参与结合，形成TFⅡD-启动子复合物；继而在TGⅡAF等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB聚合，形成一个功能性的前起始复合物。在几种基本转录因子中，TFⅡD是唯一具有位点特异的DNA结合能力的转录因子，在上述有序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效启动mRMA转录。然后由结合在增强子上的转录激活因子直接或间接与TFⅡD结合，从而影响前起始复合物的形成、稳定性以及RNA聚合酶的活性。 重组DNA技术相关概念 1克隆与克隆化
所谓克隆就是指同一副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化。为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合，即为分子克隆。 2DNA克隆
DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。 3工具酶
在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。 小结：重组DNA技术常用工具酶
（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA
（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段
（3）DNA聚合酶Ⅰ：a.合成双链cDNA中第二条链。 b.缺口平移制做探针。 c.DNA序列分析。 d.填补3′末端。
（4）Taq酶 催化PCR反应，聚合DNA
（5）反转录酶 a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 （6）多聚核苷酸激酶 催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 （7）碱性磷酸酶 切除DNA5′末端磷酸基
（8）末端转移酶 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。 （9）DNA酶：切割DNA （10）RNA酶：切割RNA
在所在工具酶中，限制性核酶内切酶具有特别重要的意义。所谓限制性核酸内切酶就是识别DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据酶的组成，所需因子及裂解DNA方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶，大部分Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。 下面小结限制性内切酶，见表。 Ⅰ类 需Mg2+、SAM及ATP 识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。 2+Ⅱ类 仅需Mg 识别切割特异性强，切割发生在识别位点。
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Ⅲ类 需Mg2+及ATP 切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。 4.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物——蛋白质。目的DNA有两种类型：cDNA和基因组DNA。cDNA是指在体外经反转录合成的、与RNA（通常指mRNA）互补的单链DNA，经聚合反应，单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA是指包含一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 5基因载体
或称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。 二、重组DNA的基本原理
一个完整的DNA克隆过程应包括：①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。 （一）目的基因的获取
目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。
1．化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。
2．基因组DNA：采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片段，继而将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，即基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含某一基因的菌株，扩增分离得到目的基因。
3． cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。用适当方法cDNA文库中就可以筛选分离到目的基因。
4．聚合酶链反应：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合成，使目的基因按指数增长。
（二）克隆载体的选择与改建 1.质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。 2.噬菌体：eg λ噬菌体、MB载体
3.柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。 4.病毒载体。
（三）外源基因与载体的连接
即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。 1．粘性末端连接
(1)同一限制酶切割位点连接 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。
(2)不同限制酶切割位点连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端，也可以进行粘性不同末端连接。 2．平端连接
3．同聚物加尾连接
同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。 4．人工接头连接
（四）重组 DNA导入受体细胞
根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。 1.感受态细胞。经一定方法处理(如CaCl2处理)后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。
2.转化、转染及感染。本定义不涉及真核细胞，只针对大肠杆菌。 转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。
转染：以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。 感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。 （五）重组体的筛选 1．直接选择法
直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测定基因表型。
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（1）抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板上幸存并形成菌落。
（2）标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救筛选。 （3）分子杂交法 2．免疫学方法
应用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，属非直接选择法。特异性强、灵敏度高，适用于选择不为宿主菌提供任何标志的基因。 （六）克隆基因的表达 1．原核表达体系
大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白。 2．真核表达体系
与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。
三、重组DNA技术与医学的关系 1疾病基因的发现
通过对基因研究认识疾病分子机制的一个典型例子是脆性X综合症。 2发展生物制药 3 DNA诊断
DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 4基因治疗
所谓基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补充基因缺陷，从而达到治疗的目的。
5遗传病的预防 (1)产前诊断。
（2）携带者测试。 （3）症候前诊断。 （4）遗传病易感性。 细胞间的信号传递：
特定细胞释放信息物质→信息物质经扩散或血循环到达靶细胞→与靶细胞的受体特异性结合→受体对信号转换并启动靶细胞内信使系统→靶细胞产生生物学功能 一、信息物质
（一）细胞间信息物质
凡由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质统称为细胞间信息物质。 分为如下三大类：
1．局部化学介质。如生长因子、细胞生长激素、一氧化氮和前列腺素等。不进入血液循环，而是通过扩散作用到达附近的靶细胞。
2．激素。由特殊分化的内分泌细胞释放，如胰岛素、甲状腺素和肾上腺素等，它们通过血液循环到达靶细胞，大多数对靶细胞的作用时间较长。
3．神经递质。由神经元突触前膜释放，如乙酰胆碱和去甲肾上腺素等，其作用时间较 短。
（二）细胞内信息物质
在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内信息物质。包括无机离子，如Ca2+；脂类衍生物，如二脂酰甘油(DAG)、N—脂酰鞘氨醇(Cer)；糖类衍生物，如三磷酸肌醇(IP3)；核苷酸，如cAMP，cGMP；信号蛋白分子，如Ras和底物酶。底物酶主要为酪氨酸或丝/苏氨酸蛋白激酶，但它们本身又是其他酶的底物，如JAK、Raf等。通常将Ca2+、DAG、IP3、Cer、cAMP、cGMP等这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。 二、受体
受体是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而引起生物学效应的特殊蛋白
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