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碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常
数测定
一、实验原理
(1).碱性磷酸酶的分离纯化 1. 机械破碎法制备肝匀浆 低浓度乙酸钠：低渗破膜 低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP 2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质
33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP 50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP (2).比活性测定 1.比活性的定义
*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 *通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。 2.测定样品的比活性必须测定： *每毫升样品中的酶活性单位数。 *每毫升样品中的蛋白质毫克数。
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3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理
(3).米氏常数测定
Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度
＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,
米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S] ＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，
以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
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二. 器材
721分光光度计 台式离心机 恒温水浴锅 微量移液
器
托盘天平 匀浆器 试管
三. 试剂
1. 0.5mol/L醋酸镁溶液 称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,
稀释至50ml.
2. 0.1mol/L醋酸钠溶液 称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水
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中,
稀释至10ml.
3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液 取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml
及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.
4. 丙酮(分析纯). 5. 95%乙醇(分析纯).
6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.
7. 0.01mol/L基质液 称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,
4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.
8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液 称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.
9. 碱性溶液 量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.
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